【预备知识】
- 糖链的生物学功能 #132
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聚糖（glycans）的有些功能是偶然发现的。
仍有很多聚糖，虽然其结构和生物合成的完整细节已被阐明，但却不知道其生物功能。
有必要设计能够区分每种聚糖介导的琐碎功能和关键功能的实验。
图 Essentials of Glycobiology, 4E. Fig. 7.2. 阐明聚糖生物学功能的方法。
该图假设特定的生物学作用是通过特定的聚糖结合蛋白识别特定的聚糖结构来介导的。这种生物学作用的线索可以通过各种不同的方法获得。
使用聚糖识别探针 (Glycan-Recognizing Probes，GRP) 定位或干扰特定聚糖
目前许多了解聚糖多样性的方法涉及提取和鉴定给定器官或组织中发现的全部聚糖，而不考虑单个细胞类型，甚至同一细胞的基底侧与顶端侧的事实可以具有广泛不同的聚糖表达模式。然而，可以使用高度特异性的 GRP（GBP 或抗体）来探索聚糖的细胞类型特异性定位。一旦特定的聚糖在有趣的生物环境中定位，很自然地会考虑将同源 GRP 引入完整的系统，希望干扰特定的功能并产生可解释的表型。这种方法可能会在聚糖功能方面产生令人困惑的结果。
一些 GRP（例如，针对聚糖的抗体）往往具有较弱的亲和力并表现出交叉反应性。尽管一些植物凝集素似乎对动物聚糖非常具有特异性，但它们通常源自通常不包含相同配体的生物体。因此，当将它们引入复杂的动物生物系统时，它们的明显特异性可能不那么可靠，在该系统中它们可能结合未知的交叉反应聚糖。最后，大多数 GRP 是多价的，并且它们的同源配体（聚糖）往往以多个拷贝存在于多个糖缀合物上。因此，将 GRP 引入复杂的生物系统可能会导致各种分子和细胞类型的非特异性聚集，并且所看到的效果可能远远超出所讨论的聚糖的生物功能。
开发源自所研究的同一系统的重组单价 GRP 模块似乎是值得的，只要它们具有足够高的亲和力。引入此类单价 GRP 作为天然功能的竞争者的效果可能会产生更多可解释的线索。
代谢抑制或糖基化改变
许多药物可以通过代谢抑制（Metabolic Inhibition）或改变完整细胞和动物的糖基化（Alteration of Glycosylation）。尽管此类试剂是阐明生物合成途径的强大工具，但它们可能在复杂系统中产生令人困惑的结果。
一个担忧是抑制剂可能会对其他不相关的途径产生影响。例如，阻断 N-连接糖基化的细菌抑制剂衣霉素也会引起 ER 应激并抑制 UDP-Gal 摄取到高尔基体中。
第二个担忧是抑制剂可能会导致聚糖合成的整体变化，从而改变糖复合物和/或膜的物理性质，从而难以解释结果。通过引入末端糖基化的低分子量引物可以获得更有用的结果，它可以作为高尔基体酶的替代底物，将合成从内源糖蛋白转移出去。然而，这种方法可以同时在内源糖缀合物上生成不完整的聚糖，并产生分泌的聚糖链，每种聚糖都有自己的生物学效应。
寻找特定受体的天然聚糖配体
由于可以在一级氨基酸序列中识别特定的**“糖识别域”（carbohydrate-recognition domains），因此现在可以预测新克隆的蛋白质是否可以结合聚糖。如果可以产生足够数量的潜在 GBP，则可以使用血凝（hemagglutination）、流式细胞术、表面等离振子共振和亲和层析等技术来寻找特定配体**。然而，假定的 GBP 与其配体的单价亲和力可能不高。因此，可能需要高密度和/或多价阵列以避免错过生物学相关的相互作用。
还出现了一个问题，即在复杂的多细胞系统中到底在哪里寻找生物学相关的配体。此外，由于许多聚糖结构可以在发育和生长的不同时间在不同组织中表达，因此重组 GBP 可以在不具有主要生物学相关性的位置和时间检测到同源结构。仔细考虑 GBP 的自然发生和表达谱应导致合理决定在哪里寻找其生物学相关的聚糖配体。
寻找识别特定聚糖的受体
可以通过与上述类似的技术来寻找这样的受体，例如血凝、流式细胞术和亲和层析。为了便于搜索，需要有合理数量的纯的聚糖，以及各种密切相关的结构作为阴性对照。由于许多生物学相关的凝集素样相互作用的亲和力较低，因此建议使用多价形式的聚糖作为探针（诱饵）。最后，在哪里寻找聚糖结合蛋白可能并不明确。例如，垂体促性腺激素的不寻常硫酸化 N-聚糖的受体的最终鉴定，不是在垂体中，也不是在这些激素的任何靶组织中发现的，而是在肝内皮细胞中发现的，在肝内皮细胞中它调节促性腺激素的循环半衰期。事实上，特定聚糖最具生物学相关性的受体甚至可能存在于另一种生物体（病原体、共生体或配偶）中。
使用可溶性聚糖或结构模拟物进行干扰
在系统中添加可溶性聚糖或结构模拟物（Structural Mimics）可以阻止内源性 GBP 和特定聚糖之间的相互作用。如果可以达到足够浓度的特定抑制剂，所产生的表型变化可能具有指导意义。在研究体外系统时，甚至单糖也可以用于此类实验，如 Man-6-P 受体途径。然而，通常需要使用高浓度的竞争性聚糖来阻断 GBP 与其配体之间相对低亲和力位点的相互作用。有时可以使用多价形式的同源聚糖来克服固有的低位点亲和力。最后，特别是在研究复杂的多细胞系统时，引入的聚糖可能会被其他已知或未知的结合蛋白交叉识别，从而给出令人困惑的表型 readout。
通过糖苷酶消除特定的聚糖结构
一种有效的方法是使用已知对特定聚糖序列具有高度特异性的降解酶。许多这样的特定酶可以从微生物病原体中获得。这种方法的优点在于在正常合成完成后选择性地消除某些结构，而不是干扰生物合成细胞机器。例如，
唾液酸酶处理淋巴细胞，消除了淋巴细胞与淋巴结高内皮小静脉的结合，并提供了 L-选择素内源性配体的第一个迹象；
将神经氨酸酶内切酶注射到发育中的视网膜中表明了 polySias 的特定作用；
将内神经氨酸苷酶（endoneuraminidase）注射到发育中的胚胎中可以使左右轴形成随机化。
在所有此类研究中，所用酶的纯度至关重要，并且需要适当的控制（最好包括酶的特定抑制剂或酶的催化非活性版本）。如果酶是细菌来源的，那么微量的污染物（例如内毒素）也值得关注。通过在完整细胞或动物中表达聚糖修饰酶的 cDNA，可以使用遗传方法来避免污染问题。例如，在小鼠中转基因表达丙型流感唾液酸特异性 9-O-acetylesterase，可导致发育早期或晚期的异常，具体取决于所使用的启动子。不幸的是，许多此类糖苷酶在完整动物的环境中可能无法很好地发挥作用或根本无法发挥作用，这可能会限制可以用这种方法探测其功能的聚糖结构的范围。
研究天然或基因工程聚糖突变体
直观上来说，这是理解聚糖功能的强大方法。在培养细胞系中研究糖基化突变体是最容易的。尽管糖基化的遗传或获得性缺陷在细胞中相对容易获得，但这些缺陷可能具有有限或不易辨别的生物学后果。这可能是因为完整生物体中缺乏其他 factors 或细胞类型。例如，聚糖的同源受体可能不存在于同一细胞类型中。当然，此类突变体仍可用于分析聚糖的基本结构功能及其与单细胞生理学的相关性。此外，可以重新引入被认为与修饰聚糖相互作用的外部因素或其他细胞类型。一些突变体也可以被重新引入完整的生物体中，例如，用于研究恶性细胞的致瘤性或转移行为。
尽管通过这些方法可以获得许多有用的信息，但聚糖的许多更具体的作用需要通过研究完整多细胞生物体中的突变来揭示。观察最近在果蝇、蠕虫、小鼠和人类中发现的各种糖基化突变体，很明显，聚糖变化通常会影响多个系统（是多效性的），并且表型是不可预测的且高度可变。通过比较自然发生的人类糖基化疾病和实验诱导的小鼠糖基化疾病的基因型-表型关系，这一点已经变得显而易见。在人类中，糖基化途径中自然发生的与疾病相关的突变通常仍会残留一些酶的功能，而小鼠中相应酶位点的缺失通常会导致胚胎发生过程中的致命表型。无论如何，在完整动物中改造糖基化突变体的价值是显而易见的。事实上，大多数主要的脊椎动物聚糖类别已在小鼠中完全消除，并且在每种情况下都导致胚胎死亡。考虑到复杂的表型和早期发育致死的潜力，以时间控制和细胞类型特异性的方式破坏糖基化相关基因的能力可能特别有价值。此外，基因工程组织模型现在可以在人体组织模型中展示每类聚糖的背景依赖性功能，例如反映人类皮肤自然分化的模型。
研究天然或基因工程聚糖受体突变体
消除特定的聚糖受体可以产生对于聚糖的功能非常有启发性的表型。与聚糖的基因修饰一样，如果在完整的生物体中进行研究，结果可能更有用。然而，受体蛋白可能具有与聚糖识别无关的其他功能。相反，所讨论的聚糖可能具有不由受体介导的其他功能。例如，CD22/Siglec-2 受体和生成其配体的 ST6Gal-I 酶的基因消除产生了互补但不相同的表型。然而，将这两种突变培育到同一只小鼠体内表明确实存在上位相互作用。通过将缺乏聚唾液酸生成能力的小鼠与缺乏聚唾液酸蛋白载体 NCAM 的小鼠交配，也获得了类似的结果。
