植物细胞的糖工程 #213
所有类型的糖蛋白聚糖的核心在哺乳动物中是高度保守的，尽管存在末端聚糖变异。
已在哺乳动物细胞中描绘出至少16种不同的糖基化途径；已生成了超过170种不同的糖基转移酶对生物合成步骤的预测遗传调控图谱。用于糖工程化的最流行的哺乳动物细胞系是60多年前建立的 CHO 细胞系。CHO 细胞系的成功部分是由于易于分离糖基化突变体，并且它是第一个用于制造具有相对简单的人类型末端聚糖、不表达抗原性非人聚糖或聚糖异常修饰的重组治疗药物的细胞。CHO 细胞系在糖工程史中占有重要地位，以凝集素选择产生的 Lec 突变株为例。这些具有糖基化基因中不同突变的细胞系为科学界提供了三十多年的工具，并说明了获取具有特定糖型的重组蛋白对于发现聚糖的生物学功能的重要性。
在工程化 CHO 和其他哺乳动物细胞系以生产人类治疗药物方面，新的简便、靶向、精确的基因编辑方法允许在任何哺乳动物细胞中通过结合敲除和敲入来设计几乎任何可想象的糖基化能力。
N-糖基化工程
核心岩藻糖基化的消除
哺乳动物细胞基因编辑的首个主要成就是消除了核心 α1−6-岩藻糖（core α1−6-Fuc），以生产具有增强 Fcγ−IIIa 受体结合能力的重组 IgG 抗体（见表 56.1）。
策略一（过表达）： 过表达双等分 GlcNAcT−III (MGAT3) 导致 CHO 细胞系稳定，其核心岩藻糖基化能力受到高度限制（此技术已由罗氏 Roche 商业化）。
策略二（同源重组）： 第二个策略采用了同源重组（HR）的“壮举”方法，敲除 CHO 细胞中的两个 Fut8 等位基因。研究人员筛选了超过 10,000 个 CHO 克隆才最终确定敲除成功的细胞。尽管这是一项了不起的成就，但这种费力的随机筛选限制了选择保留最佳生物加工属性的细胞克隆的选项。
精确基因编辑的优势： 使用精确的基因编辑技术，同样的工程改造可以被快速复制，从而提供充足的克隆用于筛选具有最佳特性的细胞。经过糖基化工程优化的 CHO 细胞系（用于抗体生产）现已商业化（如 Lonza/Kyowa Kirin BioWa 公司的 Potelligent CHOK1SV）。
代谢途径重定向： 另一种巧妙的策略是引入 GDP-6-脱氧-D-来苏-4-己酮糖还原酶，以转移内源性 GDP−Fuc 的产生，并通过外源性添加岩藻糖来实现对岩藻糖基化的精细调节。
N-聚糖唾液酸化（Sialylation）工程
N-聚糖的唾液酸化工程是该领域的另一个焦点。
CHO 细胞在 N-聚糖上仅产生 α2−3 链接的唾液酸，而人类 HEK293−T 细胞（例如）则产生 α2−3 和 α2−6 链接的唾液酸混合物。
人血清中大多数可溶性糖蛋白（包括 IgG）在 N-聚糖上具有 α2−6 链接的唾液酸，有报告表明唾液酸的链接方式可能影响免疫调节功能以及血液循环半衰期。
因此，在细胞中工程化实现更均一的 α2−6 唾液酸化引起了人们的兴趣。这些努力主要受限于过表达 α2−6-唾液酸转移酶，以期取代内源性 α2−3-唾液酸化，但结果多变。这表明在具有竞争性途径的细胞中进行糖基化工程的复杂性。
降低聚糖异质性的创新策略
一项创新的糖基化工程策略（命名为 GlycoDelete）减少了哺乳动物 N-聚糖结构的固有异质性。
研究人员将缺乏 MGAT1 的人 HEK293−T 细胞进行稳定转染，使其表达一种真菌内切 −N-乙酰葡糖胺苷酶 (EndoT)，该酶能有效地将 N-聚糖截短为一个单一的 GlcNAc。这个单 GlcNAc 可作为半乳糖基化和唾液酸化的受体。
这种带有截短 N-聚糖的重组抗体对 Fcγ 受体的亲和力较低，表明该糖基化工程策略可能适用于中和抗体的生产。
利用精确基因编辑实现途径重塑
CHO 细胞 N-糖基化途径的解构： 通过精确基因编辑，研究人员在 CHO 细胞中敲除了 19 种糖基转移酶，包括所有在 N-聚糖上发挥作用的四种 α2−3-唾液酸转移酶（见图 56.3）。
均一的 α2−6-唾液酸化： 结合敲除 St3gal4 和 St3gal6 并进行 St6gal1 的位点特异性敲入，成功实现了均一的 α2−6-唾液酸化。
设计矩阵（Design Matrix）： 组合敲除所有参与 N-聚糖唾液酸化、半乳糖基化/ LacNAc 形成、分支和核心岩藻糖基化的同工酶，为提高 CHO 细胞中 N-聚糖的均一性提供了一个设计矩阵。
实例： 敲除五个基因并敲入 St6gal1 的组合创造了糖蛋白疗法促红细胞生成素（erythropoietin），使其具有均一的双触角 N-聚糖以及末端 α2−6−Neu5Ac 结构。
广阔前景： 对 CHO 细胞中几乎所有参与 N-糖基化基因进行的广泛工程改造表明，对糖基化进行工程改造的限制很少。例如，敲除标记靶向溶酶体糖蛋白的 GlcNAc−1-磷酸转移酶（Gnptab），成功生产出带有复杂型唾液酸化聚糖的溶酶体酶，这些酶延长了血液循环时间并改善了生物分布。
图 Essentials of Glycobiology, 4E. Fig. 56.3：
(A) 一个复杂的 N-聚糖，以及负责每一步反应的糖基转移酶。图中所示的糖基转移酶同工酶基因的组合敲除，成功鉴定了控制中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中 N-聚糖分支（Mgats）、延伸（B3gnts 和 B4galts）和唾液酸化（St3gals）的主要基因（以粗体突出显示）。文中讨论的方法同样适用于负责其他类型糖基化的糖基转移酶。
(B) 在细胞上遗传性地改变不同类别聚糖表达的通用方案。可以利用糖基转移酶的基因删除、插入或激活来构建同基因细胞系。这些细胞系在内源性表面糖缀合物上会显示出不同的聚糖特征。这种经过工程改造的同基因细胞库可用于确定凝集素、毒素、抗体或病毒的结合特异性。作为示例，图中展示了选择性丧失不同类型聚糖的同基因细胞（丧失复杂的 N-聚糖 [KO MGAT1]、O-聚糖 [KO C1GALT1] 以及糖鞘脂 [KO B4GALT5/6]）。
治疗性糖蛋白的生产仍然存在异质性，包括天冬酰胺残基是否糖基化（位点占有率，宏观异质性）和/或任何一个位点上成熟聚糖结构的多样性（微观异质性）的变异。目前通过使用高度标准化的生物加工方案来确保批次间生产的可重复性来解决这个问题，但这种策略远非最佳。例如，不完全唾液酸化的治疗性糖蛋白可能被肝脏去唾液酸糖蛋白受体（Ashwell–Morell受体）清除，导致治疗性糖蛋白的循环半衰期不一致。已投入大量精力通过过表达相关的唾液酸转移酶以及抑制或敲除宿主细胞中的内源性唾液酸酶来改善唾液酸化。蛋白质特异性糖基化模式和异质性更难控制。
非人哺乳动物细胞系可以产生两种免疫原性非人聚糖：添加到 N-乙酰乳糖胺的 α1-3-Gal 和添加到 Gal 或 GalNAc 的 Neu5Gc。负责的 α1-3-半乳糖基转移酶 和 CMP-N-乙酰神经氨酸水解酶 基因在人类中是不活跃的。尽管 CHO 细胞中不产生 α1-3-Gal 和 Neu5Gc，但作为预防措施，已将这两个基因敲除。即便如此，从细胞培养中使用的动物糖蛋白中清除的 Neu5Gc 可能会出现在表达的糖蛋白中，因此使用缺乏非人糖蛋白的明确培养基也是必要的。在工程化哺乳动物细胞系时，重要的是要考虑到糖基化能力是由一部分可用酶基因的表达驱动的，但未表达的基因可以被激活。因此，细胞特异性糖基化特征通常由转录调控控制，而不是突变或基因畸变。对源自原始 CHO-K1 细胞系的五种不同 CHO 生产细胞系中所有已知的聚糖基因的分析发现，尽管存在严重的染色体改变，但没有明显的有害突变或基因丢失。这表明在糖工程策略中必须考虑哺乳动物细胞系中所有已知的聚糖基因。
CHO 细胞糖基化能力的工程化也使得治疗药物的生物偶联更均一。例如，治疗药物可以通过化学偶联 PEG 链来增强循环半衰期，但化学偶联难以定向到糖蛋白中的特定位点。已开发出一种表达后对聚糖进行酶促修饰的策略，该策略涉及重组糖蛋白的去唾液酸化，然后通过唾液酸转移酶将修饰的（PEG 化的）Neu5Ac（作为其 CMP 类似物）体外转移到暴露的 Gal/GalNAc 残基上。该过程已用于批准药物，尽管在靶向多触角N-聚糖时会发生异质修饰。现在已对 CHO 细胞进行了工程化，以生产单触角、非唾液酸化的N-聚糖，这规避了异质性，同时保留了多个暴露的 Gal 受体位点用于唾液酸化-PEG 化。
O-糖基化工程
哺乳动物细胞执行许多不同类型的O-糖基化，尽管这些发挥着多样且重要的生物学功能，但对重组治疗药物中O-聚糖的兴趣一直有限。然而，临床使用中的重组凝血因子携带 O-GalNAc、O-Fuc 和/或 O-Glc 聚糖，许多其他批准药物，包括红细胞生成素和 Enbrel，具有 O-GalNAc 聚糖。O-GalNAc 聚糖也用于位点特异性生物偶联。
O-GalNAc 聚糖的工程化涉及新的复杂程度，因为多达20种同工酶（多肽 GalNAc-转移酶）指导 O-GalNAc 聚糖的起始。因此，考虑细胞系中这些酶的库可能很重要。理论上，天然具有O-聚糖的蛋白质在特定的生产细胞系中表达时可能不会被O-糖基化，反之亦然。一个有启发性的案例是重要的磷酸尿因子 FGF23，一种先天性高磷酸血症患者的潜在药物，它需要O-GalNAc聚糖才能发挥活性。CHO 和 HEK293 细胞中多肽 GalNAc-转移酶的库已通过敲除和敲入 GALNT 基因进行了广泛的工程化，揭示了哺乳动物细胞对O-糖基化能力丧失的适应。
