相互作用蛋白质组学 (Interaction proteomics) #235
亲和纯化质谱（Affinity purification–mass spectrometry, AP-MS）是一种用于鉴定感兴趣蛋白（protein of interest, POI，也称为诱饵蛋白，bait protein）的蛋白质相互作用的技术。
与诱饵蛋白形成复合物的蛋白质称为猎物蛋白（prey proteins）。为了鉴定猎物蛋白，可使用诱饵蛋白的抗体（固相基质）与细胞裂解液孵育，猎物蛋白会随诱饵蛋白一起被亲和纯化，从而进行质谱鉴定。
一种常用方式是将亲和标签（如 His 标签、FLAG 标签等）融合到诱饵蛋白上，这样可以使用更通用的抗体进行 AP-MS [10.1016/j.cell.2011.05.006]。
亲和纯化还可以与交联和核酸测序结合，用于研究蛋白质–核酸相互作用，例如染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）和 RNA 免疫沉淀测序（RIP-seq）。
优势与局限
优势：
高灵敏度和高特异性。
可在近生理条件下检测蛋白复合体。
可与定量方法结合分析动态相互作用。
局限（common issues）：
对瞬时或弱相互作用检测能力有限（loss of weak and/or transient interaction partners）。
假阳性率高（false positive identification rates），主要原因是背景结合（non-specific binders）。Only about 3% of identified interactions had support from more than one method. (Klein‐Seetharaman*, Proteins 2006, 63, 490–500)
样品制备条件（裂解缓冲液、标签位置）可能影响复合体结构。constriction to non-native environments
IP-MS （Anti-bait AP-MS）
直接使用针对诱饵蛋白的抗体对内源蛋白进行免疫沉淀（IP）的优点是可以在组织或难以转染的细胞中使用诱饵蛋白的天然形式。
此方法的关键限制是，高质量的 IP 抗体通常难以获得，或可能表现出交叉反应。
为了避免识别同一结合位点的相互作用蛋白之间的竞争，通常优先使用多克隆抗体。
Qin 等人使用了超过 1000 种原代抗体，对与核转录功能相关的内源蛋白复合物进行了系统分析 [10.1016/j.cell.2011.05.006]。然而，在这些大规模 IP-MS 应用中，每种诱饵蛋白的 IP 条件可能需要单独优化，因为抗体在亲和力和特异性上存在差异。
为帮助选择适合 IP 的抗体，Marcon 等人开发了一种基于质谱的评估方法，系统研究了超过 1100 种 IP 抗体 [10.1038/nmeth.3472]。
Anti-tag AP-MS
基于表位标签（epitope tag）的 IP 是 AP-MS 最广泛使用的方法，尤其适用于大规模实验。
表位标签通常融合在诱饵蛋白的 N 端或 C 端，以尽量减少对蛋白结构、功能及相互作用的影响。
利用其与生化研究流程的无缝整合，肽标签（如 FLAG、HA、Strep-tag）和 GFP 标签是 AP-MS 中最常用的亲和标签。每种标签都有其优点和局限性，因此需根据具体实验目标选择合适的标签 [10.1016/j.tibtech.2019.03.016]。
相比之下，利用纳米抗体（nanobody）进行高效 AP 的 GFP 标签，是多功能标签的典型例子，可同时实现亲和纯化和荧光成像。
借助可获取的成千上万个开放阅读框（ORFs）及与不同亲和标签的轻松组合，Gateway 克隆系统可实现基于 AP-MS 的蛋白复合物分析。以 Gygi 等人主持的 BioPlex 项目为例，从超过 10,000 个带 C 端 HA-FLAG 标签的人源诱饵蛋白中识别出近 120,000 个蛋白–蛋白相互作用（PPI） [10.1016/j.cell.2015.06.043][10.1038/nature22366][10.1016/j.cell.2021.04.011]。
内源水平标签（Endogenous Level tagging）
基于表位标签的 AP-MS 方法一个问题是诱饵蛋白的过表达，这会改变蛋白复合物的计量比并可能引入人工效应 [10.1038/nmeth742][10.1038/nmeth.2377]。
为缓解这一问题，可采用多种基因技术保持表位标签诱饵蛋白的内源水平表达。
一种常用方案是可诱导表达系统，用于控制表达水平。例如，Flp-In T-REx 系统可以快速生成同源细胞系，外源基因通过 Gateway 兼容克隆导入，并由四环素诱导启动子控制蛋白表达 [10.1038/s41467-018-03523-2][10.1038/nmeth.2703][10.1038/nmeth.2702]。然而，由于蛋白表达通常不呈线性响应四环素诱导，实现内源水平表达仍具有挑战性。
另一种方法是使用细菌人工染色体（BAC）重组技术，生成稳定细胞系，使标记蛋白接近内源表达水平 [10.1083/jcb.200911091]。Mann 等人使用 BAC 系统生成超过 1,100 个稳定 HeLa 细胞系表达 GFP 标记蛋白，并全局绘制蛋白复合物图谱。然而，标记蛋白与内源蛋白可能竞争相同结合伙伴，从而降低 AP-MS 分析的灵敏度。
参考文献示例：
BAC: [10.1016/j.cell.2015.09.053]
Gateway: [10.1038/nmeth.2400][10.1016/j.celrep.2013.03.027]
弱启动子: [10.1016/j.cell.2009.04.042]
CRISPR/Cas9 技术可在目标基因组位点实现表位标签的单拷贝插入，从而保持内源水平表达 [10.1038/nprot.2013.143]。随着 CRISPR/Cas9 文库的发展，越来越多研究采用该技术研究内源水平蛋白复合物 [10.1021/acs.jproteome.8b00367]。
原代细胞和活体动物模型
为了将基因标签系统应用于难以转染的原代细胞，慢病毒传递系统被优化用于 AP-MS 研究 [10.1074/mcp.TIR118.000902]。
开发了表达标记诱饵蛋白的敲入小鼠，用于活体内源信号复合物的 AP-MS 分析 [10.1016/j.celrep.2017.03.019][10.1038/s41590-019-0489-8]。例如，Voisinne 等人为研究 T 细胞抗原受体（TCR）激活后的信号复合物，构建了 15 个敲入小鼠，每个小鼠在 TCR 信号中表达一个 Strep 标签的典型蛋白。对 CD4+ T 细胞中 15 个标记诱饵的 AP-MS 分析共识别出 277 个蛋白，涉及 366 个 PPI。
合成肽拉下（Synthetic peptide pulldown）
链接：Peptide pull-down
大规模 AP-MS
目标是覆盖完整分子功能或整个蛋白质组。
在 96 孔板中进行亲和纯化和消化，可显著提高样品处理通量并降低变异性。
Mann 等人首次使用 96 孔过滤板进行孔内 AP。由于亲和树脂保留在过滤器上，细胞裂解液孵育、树脂洗涤和珠上消化在一体化、高通量方式下完成 [10.1016/j.molcel.2012.10.026]。该方法最近应用于 1000 多个 pTyr 肽的 AP-MS 分析 [10.1016/j.cell.2019.09.008]。
Tian 等人使用链霉亲和素涂层 96 孔板进行孔内 AP 和消化 [10.1021/acs.analchem.0c00839]，即使使用低至 5 μg 细胞裂解液，也能识别 pTyr 信号复合物。
Meyer 等人使用纤维素膜进行大规模肽拉下实验，研究疾病突变。膜上原位合成数百种不同肽，并与蛋白提取物直接孵育 [10.1016/j.cell.2018.08.019]。捕获的相互作用蛋白在 96 孔板上进行膜上消化，并结合 SILAC 和无标记定量（LFQ），有效区分非特异吸附和突变依赖的蛋白复合物。但为了避免错误序列，纤维素膜上合成肽的长度限制为 15 个氨基酸 [10.1074/mcp.R120.002034]。
Furlan 等人报道了一种微流控自动化 AP 平台，将 AP 与珠上消化整合在纳升级别 [10.1038/s41467-019-09533-y]。该平台可在低至 4 μg 细胞裂解液条件下进行 AP-MS 分析。
其他自动化和系统级参考：
自动液体处理平台、96 孔板: [10.1038/msb4100134]（338 个诱饵蛋白，FLAG 标签）；[10.1083/jcb.200911091]
人类蛋白–蛋白相互作用系统分析: [10.1016/j.cell.2015.06.043][10.1016/j.cell.2015.09.053][10.1038/nature22366][10.1016/j.cell.2021.04.011]
酵母蛋白–蛋白相互作用系统分析: [10.1038/nature04532][10.1038/nature04670]
代表性文献
Gavin et al., Nature, 2002 — 系统绘制 Saccharomyces cerevisiae 的蛋白互作网络。
Gingras et al., Nat Rev Mol Cell Biol, 2007 — Comprehensive review on AP–MS principles and applications.
Huttlin et al., Cell, 2015 — BioPlex 网络，基于 AP–MS 的人类蛋白互作组数据库。
