糖蛋白质组学的碎裂方法 (MS Fragmentation for glycopreteomics)
经过富集的糖肽通常会进行液相色谱（LC）分析，随后进行串联质谱（MS/MS）分析。目前最常用的糖肽分析流程是将反相高效液相色谱（reverse-phase HPLC）与电喷雾电离（electrospray ionization）耦合使用。
糖肽随后会通过不同类型的碎裂技术（即串联MS）进行分析，以实现对肽段的测序、糖链结构的识别以及糖基化位点的定位。
在糖蛋白质组学中，常用的两种碎裂技术为：(i) 分步碰撞能量HCD（stepped-collision energy HCD），以及 (ii) HCD触发ETD或EThcD（HCD-pd-ETD）[93]。
MS 碎片化已成为聚糖结构表征的金标准。目标是生成信息丰富的碎片谱，从而明确分配聚糖结构。然而，在目前的最新技术中，来自碰撞聚糖分子离子的碎片（碰撞诱导解离 [CID]——无论是“束型”还是“离子阱型”）只能部分确定感兴趣的结构。我们可以根据它们携带的信息类型和数量来区分三种类型的聚糖碎片离子。
图 Essentials of Glycobiology, 4E. Fig. 51.3. CID-MS/MS 分析释放的 N-聚糖。 (A) 释放的 N-聚糖的质谱 (MS)：质量以双电荷离子的形式显示，并附带相应的单糖组成。 (B) m/z [1098.25]^{2-} 的 CID-MS/MS：描绘了所得碎片的质量。 (C) Domon 和 Costello 键裂 的图示：显示了产生 B 中所见碎片的聚糖结构。 Rel. Int. (Relative intensity)：相对强度。
B-型和 C-型碎片离子根据定义包括非还原端碎片，它们分别源于单个糖苷键的裂解，带或不带糖苷氧。还原端碎片被指定为 Y-型（带糖苷氧）和 Z-型（不带糖苷氧）碎片离子。
跨环碎片可被指定为非还原端碎片（A-型）和还原端碎片（X-型），并且需要进一步注释以指定碳环中哪些键解离以形成跨环碎片离子。
内部碎片来自不止一个碎片化事件，由糖苷键和/或跨环碎片化的组合产生。
理想情况下，包含所有可能的糖苷键碎片的碎片谱将允许分配聚糖结构的一级序列和分支。然而，在实践中，大多数 CID 方法提供糖苷键碎片，但通常使用几种方法或方法的组合（LC 保留时间、外切糖苷酶消化、离子模式、衍生化、多重碎片化步骤，即 MSn）来完全定义感兴趣的特定结构。生物合成规则可以并且通常被应用于辅助聚糖表征。
CID/HCD
碰撞活化解离（collision-activated dissociation, CAD） 是一种常见的碎裂方式，利用氦原子与肽段发生碰撞[90]。其束流类型的变体称为 高能碰撞解离（higher-energy collisional dissociation, HCD），在 Orbitrap 仪器上使用氮气代替氦气[91]。这些碰撞会向肽段传递振动能量，最终导致最不稳定化学键的断裂。对糖肽而言，最易断裂的键是糖苷键，包括：(i) 肽链与糖链之间的连接键，和/或 (ii) 各单糖之间的糖苷键。因此，所得质谱图中通常以糖链从肽链上脱落、质子化糖链碎片、以及裸露的b型或y型肽段碎片为主 [86,92,93]。
ETD
电子转移解离（electron transfer dissociation, ETD） 开发的部分原因是为了克服糖链优先碎裂的问题，从而实现糖基化位点的明确定位[94,95]。由于ETD不依赖碰撞，而是通过电子转移进行碎裂，因此糖链能够完整保留在肽段上，从而有助于确定糖基化位点[31,96]。但ETD的局限在于，它需要较高的电荷密度，而这在大分子（>1000 m/z）的糖肽前体中往往不具备。为克服此问题，一些研究团队在ETD中引入了辅助激活，如EThcD（ETD加高能碰撞） [92,97,98] 和AI-ETD（激活离子的ETD） [63,99]。
Stepped-HCD
Stepped-HCD是糖蛋白质组学中最常用的最常见的碎裂技术，适用于N-糖蛋白质组学。
在分步HCD中，对同一前体离子施加三个不同的碰撞能量，产生的产物离子被共同累积并分析[100,101]。
HCD-pd-ETD
尽管糖肽富集方法具有较高的效率，但在富集样品中，糖肽仍可能是相对稀有的成分。为此，研究人员开发了多种质谱（MS）筛选方法，以提高糖肽的检测效率及其后续鉴定的成功率。最早实现该目标的方法之一是采用产物依赖型MS–MS分析（product dependent MS–MS events），即在HCD过程中观察到GlcNAc/GalNAc 氧鎓离子（oxonium ions）后，触发电子转移解离（ETD）碎裂事件 [J Proteome Res 2011, 10:4088-4104；Int J Proteomics 2012, 2012:560391]。
HCD-pd-ETD方法通常可以实现糖基化位点的明确定位[102,103]。此外，化学修饰的糖链可产生更多可用的触发离子，进一步提升定位效果。
ETD碎裂事件的获取速度通常远慢于HCD扫描。这类现在被称为“探测式质谱采集方法（scouting MS acquisition methods）”的策略，能够更有选择性地使用ETD。但其前提是候选糖肽必须先经过HCD碎裂，才能被纳入ETD分析。
HCD-pd-ETD方法对于提高O-糖蛋白质组鉴定深度是很有帮助的。
其他
ultraviolet photodissociation [117,118]
infrared spectroscopy–MS and/or infrared multiphoton dissociation [119,120]
聚糖修饰 (Glycan Modifications)
许多关键的聚糖修饰，例如 O-乙酰化、丙酮酸酰化等，不稳定和/或被当前的分析方法所遗漏。这个问题可能导致数据库中有误导性或有偏差的信息。
举一个例子，尽管许多数据库假设脊椎动物聚糖链末端的唾液酸是 N-乙酰神经氨酸，但自然界中实际上有数十种修饰的唾液酸，而且这些差异可能对生物学功能产生深远影响。
对于 HexNAc 和己糖胺残基上的 N-和 O-硫酸酯也是如此。
