【预备知识】
- 糖组 (Glycome) #186
糖组学（Glycomics）构建了从感兴趣的细胞、器官或生物体的蛋白质或脂质支架上分离出来的聚糖清单。这是任何全面糖组分析的重要起点。
作为一个典型实验的例子，从细胞裂解物中制备富集糖蛋白的样品，并通过液相色谱 (LC) 和/或质谱 (MS) 分析其释放的聚糖。在糖蛋白的情况下，N-聚糖可以酶促或化学选择性释放，通过高效液相色谱 (HPLC) 方法分离，并且通常通过串联质谱 (MS/MS) 在线测序，有或没有外切糖苷酶处理。O-聚糖可以单独通过化学方法释放并以类似方式测序。相比之下，糖脂通常可以直接测序，有或没有从脂质组分中释放。GAGs 由于其大尺寸和负电荷而更成问题，但二糖片段可以通过 LC 或 MS 结合酶消化进行测序。
根据所需的细节级别，糖组学分析可分为基本技术：聚糖谱分析、聚糖类别表征和从蛋白质中释放的聚糖的完整结构分析。理想情况下，细节级别应根据手头上的特定问题进行定制。
聚糖谱分析（Glycoprofiling，指纹图谱分析，模式分析）是通过一种技术对复杂聚糖混合物进行分离，该技术提供一个特征或指纹，以提供样品中聚糖的简单概述或快照。提供不同一维窗口的技术有：有或没有 MS 的 HPLC（根据理化参数，如亲水性、大小或电荷进行分离）、毛细管电泳（根据质量/电荷分离标记的聚糖），以及 MALDI 和/或电喷雾电离 (ESI) MS（根据质量/电荷分离未标记或标记的聚糖）。
聚糖类别表征（Glycan class characterization）使用技术根据结构特征将聚糖混合物分离成不同类型的聚糖。示例包括：MS 分离二、单和非半乳糖基化的 IgG 聚糖，或弱阴离子交换 (WAX) LC 基于电荷的分离，将聚糖分离成中性、单、双、三和四唾液酸化结构类型。这种方法是突出定义的关键特征并提供不同聚糖类别的相对定量的便捷方式。LC-MS 分析还可用于将释放的 N-聚糖结构分离成少甘露糖、寡甘露糖，以及杂合和复杂唾液酸化和非唾液酸化聚糖类型。
详细（完整）结构分析（Detailed (full) structural analysis）需要确定聚糖的序列以及单糖的任何修饰、分支点、异头构型和糖苷键。在这种详细分析中，通常需要正交技术，首先分配初步结构，然后确认分配。例如，阴离子交换分离成不同电荷的聚糖类别可以辅以每个类别的亲水相互作用液相色谱 (HILIC) 分离。然后可以使用外切糖苷酶消化来帮助确定不同聚糖的序列、异头构型和连接方式。另一方面，MS 分配与质量数据一致的组成，并且可以通过（LC）ESI MS/MS 或 MSn 碎片化来解析结构细节。如果 MS 的准备过程可能会破坏具有不稳定修饰（如 O-乙酰化或多唾液酸化）的唾液酸残基，则可能需要单独释放和分析它们。
完整的聚糖结构分析还可以包括分配的聚糖结构的绝对或相对定量，例如：旨在启动抗体依赖性细胞毒性 (ADCC) 的抗体上的核心岩藻糖水平、抗原性 α-半乳糖残基的水平、唾液酸-Lewis x 表位（可能是炎症和转移的有用标志物），或与细菌蛋白质结合的特定结构。
聚糖的完整结构分析具有挑战性，因为不同结构可以具有相同的质量，在分离系统上经常共洗脱，并且可能需要对 MS/MS 谱图进行详细的手动注释。通常，聚糖通过一种技术给出初步结构分配，然后通过至少一种正交技术进行确认。目前正在开发生物信息学工具来尝试减轻这一瓶颈（第52章）。
聚糖从蛋白质中的释放 (Release of Glycans from Proteins)
糖组学分析中的起始材料可以是嵌入凝胶中的糖蛋白、全细胞裂解物的蛋白质提取物、均质化的组织、富集的膜组分，或血清和其他体液。对于糖组的高通量分析，完整的 N-聚糖最常使用酰胺酶（肽 N- 糖苷酶 F [PNGaseF]）从糖蛋白中释放。PNGase F 裂解 NXT/S (X=P) 共有序列中核心 GlcNAc 与天冬酰胺残基之间的连接，裂解所有类别的 N-聚糖，但植物和无脊椎动物糖蛋白中含有与连接到蛋白质的核心 GlcNAc 残基 α(1,3) 连接的岩藻糖的特定 N-聚糖除外。PNGase A，一种从杏仁乳液中提取的酶，可用于从蛋白酶生成的糖肽中释放所有核心岩藻糖基化的 N-聚糖。
也可以用其他内切糖苷酶进行处理，这些酶在几丁二糖核心内的两个 GlcNAc 残基之间进行裂解（例如，内切糖苷酶 D，释放少甘露糖型 N-连接聚糖；内切糖苷酶 H，选择性裂解寡甘露糖型和杂合型结构；以及各种类型的内切糖苷酶 F）。在处理之前，可以使用和不使用胰蛋白酶消化进行变性，以放松蛋白质的三维 (3D) 结构并提高酶的可及性。N-聚糖也可以方便地从 SDS−PAGE 凝胶条带中纯化的糖蛋白中释放。在 N-聚糖被裂解后，保留在凝胶中的蛋白质可以通过传统蛋白质组学进行鉴定。
对于丝氨酸 (S) 和苏氨酸 (T) 上的 O-连接聚糖释放，首选的方法是化学还原 β-消除。该方法的缺点包括：由此产生的 O-连接糖醇不能在还原端进一步标记，以及不稳定修饰可能在释放过程中被破坏。迄今为止，没有酶可以释放所有类别的 O-连接聚糖。O-聚糖酶（与 PNGase 酶不同）仅限于释放简单的核心 1 (Galβ1−3GalNAcαS/T)O-聚糖。
释放聚糖的分析 (Analysis of Released Glycans)
N-和 O-连接聚糖的 LC、CE 和 MS 衍生化 (Derivatization of N- and O-Linked Glycans for LC, CE, and MS)
释放聚糖的标记可以优化 HPLC 和毛细管电泳 (CE) 的可检测性和可分离性，并可能改善其 MS 特性。其中许多标记方法使用聚糖在还原端的还原胺化，或与 PNGase F 释放后留在还原端的游离胺反应。荧光标记物通过降低定量和检测限来增加灵敏度。全甲基化和全乙酰化，即聚糖中所有可移动的质子（存在于羟基、羧基和酰胺上）被烷基（例如，-甲基）取代或酯化（例如，-乙酰基）时，将聚糖从亲水性转化为疏水性，使聚糖更容易纯化并极大地提高了基于 MS 的分析的灵敏度和连接测定。
N-和 O-聚糖也可以作为糖醇进行分析，其中还原端单糖环通过还原剂（例如，硼氢化钠）转化为还原的线性糖醇。这种还原消除了碳水化合物的异头模糊性，否则还原端糖的 α 和 β 异构体可能会在色谱上分离成两个峰。
释放聚糖还原端的标记（例如，用 2-氨基苯甲酰胺 [2-AB]、氨基苯甲酸 [2-AA] 或氨基吡啶 [2-PA]）常用于HILIC 和反相 LC 分离释放的聚糖（图 51.1）。标记的葡聚糖寡聚物梯通常在 LC 中用作外部标准品，以帮助根据可比较的保留时间定义组成和大小，可以计算结构中存在的每个单糖的“增量值”（图 51.1）。
带有激光诱导荧光 (LIF) 的 CE 也可以提供有效、快速和定量的衍生化聚糖分离。聚糖大多是中性结构，因此需要耦合带电荷的荧光标记物，例如 1-氨基芘-3,6,8-三磺酸 (APTS)，以提供电泳迁移率并实现灵敏的荧光检测。在外切糖苷酶消化聚糖混合物后可以分配更多细节，外切糖苷酶特异性地从末端残基裂解单个单糖单元的糖苷键，从而在消化产物的 HPLC 或 CE（或 MS）图谱中产生可预测的位移。
还开发了特殊的衍生化方案来改善唾液酸化聚糖的 MS 碎片谱图的质量——特别是针对唾液酸残基带电荷的羧基。这些可以转化为酯或酰胺，以去除羧酸的酸性质子，该质子会破坏 MALDI-MS 中唾液酸的稳定性，并促进 MS/MS 中不希望的离子源内或离子源后碎片化。唾液酸残基的特异性衍生化还可以帮助通过 MS 确定它们是 2,3-还是 2,6-连接到聚糖结构。
糖组学分析的未来
目前，将聚糖从蛋白质中释放出来是糖组学的先决条件。
N-连接和 O-连接糖组学仍然是唯一可以详细描述细胞表面整体聚糖结构景观的技术（如果与质膜富集结合应用），因此在可预见的未来，它们仍将是定义细胞-细胞相互作用和发现疾病生物标志物和新治疗靶点的有效方法。
然而，未来可能不需要对每一个单独的聚糖都进行从头分析。使用包含许多更普遍表达的聚糖的碎片库进行碎片谱图匹配正成为快速完全或部分分配大多数结构的途径，并允许研究人员专注于仅对解决生物学问题重要的结构的验证。与蛋白质组学类似，自动化聚糖鉴定理想情况下应通过严格的置信度阈值进行，例如，通过确定报告鉴定的错误发现率。新的碎片化技术、离子淌度 MS 的引入，以及重同位素单糖或标记物的体内或体外掺入开始为目前糖组学质谱技术所缺乏的异构聚糖结构表征、定量和可视化提供其他机会。
从糖组学到糖蛋白组学分析
糖组学鉴定出重要的糖基化特征后，一个经常随之而来的关键问题是：哪些蛋白质携带了所涉及的聚糖结构，以及在哪些位点？
定义与单个蛋白质或脂质相关联的特定聚糖。例如，对细胞糖缀合物的完整库的分析，包括单个附着位点上存在的聚糖的微观异质性，位于糖组学与蛋白质组学（“糖蛋白组学”，glycoproteomics）以及糖组学与脂质组学（“糖脂组学”，glycolipidomics）的交集。
确定在特定时间或条件下，哪些聚糖和/或糖缀合物在特定细胞、组织或分泌物中表达。如果目标是揭示细胞-细胞通讯中的新功能或将特定糖组与特定疾病相关联，则此级别的分析至关重要。
细胞表面或细胞外基质中存在的复杂聚糖森林的实际排列。糖组在细胞表面上的空间组织目前只能通过使用各种聚糖识别探针（凝集素/GRP）的显微镜、芯片和流式细胞术成像来进行。组织切片中聚糖的空间组织也可以通过最近的基质辅助激光解吸/电离 (MALDI) MS 成像方法进行探索。
