【预备知识】
- 糖基化位点鉴定 #255
糖蛋白包含许多糖型
糖蛋白通常在特定的 Asn-X-Ser/Thr N-糖基化基序上具有一系列不同的 N-聚糖，导致每个位点的糖链异质性。此外，当每个分子有不止一个 Asn-X-Ser/Thr 基序时，群体中不同的分子可能在不同的基序上具有不同的 N-聚糖子集，导致糖蛋白微观异质性。仅在 聚糖组成上有所不同的糖蛋白被称为糖型（glycoforms）。
糖蛋白 N-聚糖的变化可能归因于：影响高尔基体糖苷酶或糖基转移酶底物可及性的蛋白质构象、核苷酸糖代谢、糖蛋白通过 ER 和高尔基体腔的转运速率，以及 Asn-X-Ser/Thr 基序与跨膜结构域的邻近程度。此外，糖基转移酶在高尔基体亚区室中的定位可以决定哪些酶遇到 N-聚糖受体。需要注意的是，糖基化酶通常会竞争相同的受体，并且大多数糖基转移酶和糖苷酶在它们能够作用之前，需要其他糖基转移酶和糖苷酶的预先作用。
蛋白质特异性和位点特异性糖基化是蛋白质糖基化公认的特征。
虽然蛋白质特异性和位点特异性糖基化的潜在分子基础尚未完全理解，但促成因素可能包括共同的序列基序、蛋白质结构构象、糖基化位点周围独特的理化斑块，或一些尚未知晓的特征，这些特征共同作用，允许单个蛋白质从数百或数千个其他蛋白质中被挑选出来，以特定的方式被糖基化机制作用。
并非每个序列 (NXT/S) 都会携带 N-聚糖，在极少数情况下，被利用序列的 T/S 位置可以被 C 取代。实际糖基化位点通常携带异质的聚糖结构集合。
理想情况下，糖蛋白组学需要能够识别样品中的所有糖蛋白，直至哪个位点被占据（宏观异质性）的水平，并量化和表征该位点的各自糖型（微观异质性）。最终目标是实时获取细胞中每个糖蛋白上不同聚糖分布的快照，以推断位点特异性糖基化如何促进或干扰细胞相互作用或信号传导事件。最终，为了理解蛋白质糖型的特定生物学作用，我们将需要定义由多个位点位点特异性聚糖多样性组合产生的每种分子物种的群体。
尽管近年来开发出了有前景的糖蛋白组学方法，但在复杂混合物中使用 LC−MS/MS 明确鉴定完整糖肽仍然具有挑战性。与分析未修饰肽段或携带简单修饰的肽段的相应蛋白质组学方法相比，这些工作流程的成熟度较低。基于适当错误发现率 (FDR) 的糖肽鉴定策略正在出现，但尚未充分整合到工作流程中，因此可靠的鉴定仍然依赖于经验丰富的用户的手动数据探究。
大多数糖蛋白组学方法依赖于对单同位素糖肽前体离子的准确质量分析（低 ppm）来准确指定完整糖肽的分子质量。碎片离子也受益于高分辨率检测以辅助谱图分配。
对于 N-糖肽，CID（无论是在离子阱还是四极杆飞行时间 (QTOF) 平台上），或越来越多地通过更高能量碰撞解离 (HCD)（可在一系列 Orbitrap 质量分析仪上使用），主要诱导糖苷键裂解，在低质量区域产生丰富的聚糖 oxonium 离子，辅以糖基残基从糖肽前体连续中性丢失，直到 Asn 上的单个 GlcNAc。丰富的诊断 oxonium 离子能够快速准确地对所有含糖肽的谱图进行广泛分类，提供单糖组成和拓扑结构的细节，通常足以允许可靠的糖肽鉴定。在有利的情况下，可以分配 Y1 离子（肽骨架 +GlcNAc），其 m/z 可用于定义携带聚糖的肽的分子质量。此后，前体离子质量在减去肽质量后给出附着聚糖的组成。最近，阶梯式 HCD（生成具有不同碰撞能量的相同物种的多个碎片谱图）已被证明可以生成丰富的谱图，用于分配聚糖和肽。
图 . N-糖肽的互补串联质谱 (MS/MS) 碎片化。(A) 糖肽 的CID-MS/MS 和HCD-MS/MS 都会产生聚糖的裂解，从而给出诊断性的 ox 离子（oxonium ions），以及一系列糖基残基的中性丢失，这通常会导致单个 GlcNAc 留在肽段上（Y1 离子）。HCD 还可以产生足够的肽段碎片（b/y 离子），从而能够识别肽段骨架，进而识别来源蛋白，但通常不提供连接位点的直接证据——如果只有一个位点，通常将其分配给 Asn 序列基序（sequon）上的天冬酰胺 (Asn)。(B) 电子转移解离 (ETD)-MS/MS 会导致肽段骨架的裂解，同时保持聚糖完好无损地留在位点上。它可以辅以 HCD (EThcD) 来产生一个包含两者信息的混合谱图。
当对更不稳定的 O-糖肽进行 CID/HCD 碎片化时，糖基残基通常会从肽载体上脱离，因此产生没有缀合聚糖的 b-型和 y-型离子。限制还在于无法指定修饰位点。
电子转移解离 (ETD)，在附加 CID- 或 HCD- 的情况下，分别称为 ETciD 和 EThcD，可实现信息更丰富的糖肽谱图。原则上，ETD 产生源于沿肽骨架的肽键裂解而不诱导糖苷键裂解的 c-型和 z-型离子。因此，保留完整聚糖的所得 c-型和 z-型离子可用于鉴定肽载体和修饰位点，这一特征对于 O-糖肽特别有用，因为无法根据肽序列可靠地预测位点分配。
实际问题是 ETD 效率取决于糖肽的电荷密度。对于双电荷和三电荷 N-糖肽（占所有胰蛋白酶肽段的很大一部分），通常观察到相对较低的解离效率。解决这个问题的一种方法是增加糖肽的电荷状态，方法包括化学衍生化（例如，使用串联质量标签 [TMT]）、在 LC 溶剂中使用超电荷剂，以及/或使用不同的蛋白水解酶（例如 LysC 或 GluC 而不是胰蛋白酶）来生成更大的糖肽。使用 EThcD（补充激活）和/或更长的 ETD 激活时间也可能通过促进已电荷减少的未解离前体的解离来产生信息更丰富的谱图。
ETD 对 O-糖肽的效果相当好，特别是那些仅装饰有一个或两个糖基残基的 O-糖肽，包括 O-GlcNAc、O-GalNAc (Tn)、O-GalNAc-Gal (T)、O-Fuc 和 O-Man。通过保留这些糖基取代基，ETD 理想地允许鉴定它们在几个紧密放置的 Ser/Thr 残基上的分布，这在 CID 或 HCD 中是不可能的。
创新 LC−MS/MS 采集策略正越来越多地用于增强糖蛋白组学实验的性能。例如，HCD−MS/MS 碎片化产生的 m/z 为 204 的丰富 HexNAc oxonium 离子是任何类型 N-和 O-连接糖肽的有用诊断离子。产物离子依赖性 ETD，或引起此类 HexNAc（或其他） oxonium 离子的前体的 EThcD 触发，是定制仪器以采集更多糖肽特异性信息数据的巧妙策略，从而实现更高的糖蛋白组覆盖率，而无需事先富集糖肽。
与蛋白质组学中肽段的定量类似，完整糖肽的定量可以使用无标记或标记辅助（例如，TMT）策略进行。定量类型取决于手头上的问题，但可能涉及每个糖基化位点所有聚糖的相对定量（糖蛋白组定位）、比较不同条件下单个位点的糖谱（比较糖蛋白组学），或者更简单地确定两种或更多条件下单个糖肽形式的相对丰度（生物标志物发现）。通常需要多种定量方法以及蛋白质水平和位点占有程度的信息才能从糖蛋白组学数据中提取具有生物学相关性的信息。
