表面蛋白质组学 (Surfaceomics)

一号

用于表面糖蛋白组分析的富集方法

超速离心（Ultracentrifugation）

超速离心是一种经典方法，用于将质膜从细胞中分离出来。[1]
为了提高质膜组分的纯度，研究者采用密度梯度离心，特别是通过蔗糖梯度介质来富集细胞表面蛋白。[2][3]
然而，超速离心无法完全去除质膜组分中的可溶性或胞质蛋白。

NHS 标记（NHS Labeling）

蛋白质生物素化被用于特异性标记定位于细胞表面的蛋白质胞外区段，随后通过亲和富集进行分离。[4][5]

酶切剃除法（Enzymatic Shaving）

该方法依赖酶切作用去除细胞表面蛋白暴露于胞外的结构域，从而实现对表面蛋白的分析。

细胞表面捕获法（Cell-Surface Capture, CSC）

Zhang 等人[6]（2003）首次将周期酸氧化与肼化学（hydrazide chemistry）结合，开发出一种优雅的富集糖蛋白的方法。
随后，Wollscheid 等人[7] 引入 CSC 技术用于大规模表面糖蛋白分析。他们系统优化了细胞表面糖蛋白氧化的条件（如周期酸浓度及反应条件），以维持细胞完整性并最小化副反应。氧化后的糖蛋白含有醛基，可在活细胞上与生物素肼（biocytin hydrazide, BH）共价标记。裂解细胞并消化蛋白后，利用链霉亲和素磁珠富集生物素化糖肽，随后通过 PNGase F 酶切释放糖肽。
CSC 能够实现细胞表面糖蛋白的位点特异性分析，显著降低表面糖蛋白鉴定的假阳性率。

CSC 已被用于分析小鼠、人类细胞系及原代细胞的表面糖蛋白。[8]
Bausch-Fluck 等人[9]（2015）应用 CSC 分析 41 种人类细胞系和 31 种小鼠细胞系的表面糖蛋白，分别鉴定出 1492 和 1296 种糖蛋白，并建立了 细胞表面蛋白图谱（Cell Surface Protein Atlas, CSPA）。
该图谱为细胞类型分类提供了重要信息，也可作为筛选细胞表面药物靶点的平台。基于 CSPA 的机器学习训练数据，该团队还开发了预测工具 SURFY，以超过 93% 的准确率预测了 2886 种细胞表面蛋白。[10]

为提升性能，不同版本的 CSC 被开发，主要集中在优化醛基标记条件（如添加催化剂、使用不同生物素化试剂、在肽或蛋白水平进行富集）。
Kalxdorf 等人[11] 使用 烷氧胺-PEG4-生物素（alkoxyamine-PEG4-biotin） 替代 BH 进行标记，并引入苯胺作为催化剂以提高标记效率。
他们在蛋白水平而非肽水平上富集生物素化的表面糖蛋白，并利用磁珠上直接酶切得到的非糖肽进行鉴定和定量。优化后的流程鉴定出更多质膜蛋白，因为避免了 PNGase F 酶切过程中脱氨反应。然而，该方法缺乏位点特异性信息，表面糖蛋白富集特异性下降（约 70% vs. CSC 的 95%）。

虽然 CSC 在全面分析细胞表面糖蛋白及其胞外拓扑结构方面非常有效，但由于试剂对组织样品的渗透性有限且通常需要较多起始材料（>10⁷ 个细胞/样本），因此多用于培养细胞而非临床样本。

自动化 CSC（AutoCSC）

AutoCSC 结合了流程微型化与自动化。[12]
在氧化标记、裂解和消化后，生物素化肽可通过机器人自动完成链霉亲和素结合、清洗与洗脱，减少手工操作损失并提高灵敏度。
AutoCSC 的灵敏度提升约 5 倍，变异系数更低。每个样本仅需 1×10⁶ 个发育中 B 细胞，即可定量 147 种蛋白上的 248 个独特糖基化位点。
Gundry 课题组近期还开发了自动化生物信息学流程，以结合蛋白组学与转录组学数据快速解析 CSC 数据，从而发现细胞类型特异的表面标志物。[13]
未来，样品制备与数据分析的完全自动化有望进一步提升 CSC 的效率。

基于酶的标记方法（Enzyme-Based Methods）

与周期酸氧化相比，酶催化标记条件更温和且效率更高。半乳糖氧化酶（Galactose Oxidase, GAO） 可用于标记细胞表面的糖蛋白以进行大规模分析。[14]
吴课题组系统优化了 GAO 方法的条件，显著提高了其性能。[15][16]
通过引入**辣根过氧化物酶（HRP）增强氧化效率，并使用甲氧胺（methoxylamine）**替代 PNGase F 进行糖肽洗脱，提高了回收率。
结合去唾液酸酶（sialidase）去除糖链末端唾液酸后，方法表现更优。
整合 GAO 法与 SILAC（稳定同位素标记）可系统分析表面糖蛋白的运输途径，揭示多数表面糖蛋白经经典分泌通路转运至质膜。

化学酶标记（Chemoenzymatic Labeling）

化学酶标记是一种广泛用于研究细胞表面糖蛋白的策略。
该方法通过重组糖基转移酶，将带有化学报告基团的糖核苷酸供体转移到细胞表面的特定糖链受体上。

Yu 等人[17]（2016）开发了两步选择性外酶标记法（Selective Exo-Enzymatic Labeling, SEEL），研究人红白血病细胞分化过程中表面糖蛋白的变化。
他们利用重组的 α-(2,6)-唾液酸转移酶（ST6Gal1） 或 α-(2,3)-唾液酸转移酶（ST3Gal1），以及含叠氮基的 CMP-Neu5Ac 类似物进行标记，随后通过点击化学进行生物素化、富集并鉴定。
在化学酶标记前加入神经氨酸酶处理可显著提高表面糖蛋白鉴定率。

为减少两步 SEEL 中点击化学的副反应和低效率，Sun 等人[18]（2016）合成了带生物素基团的 CMP-Neu5Ac，实现一步直接标记。
该一步 SEEL 比传统两步法标记效率更高，并发现如 IGF2R 和 EPHA2 等糖蛋白在溶酶体功能障碍下的内吞降解减少。
此外，由于糖基转移酶具有特异识别性，化学酶标记还可用于分析含特定糖链的表面糖蛋白。[19]

例如，ST6GalNAc-IV 可识别 唾液酸化 TF 抗原（Sialyl-T），并将带生物素基团的唾液酸类似物转移到其上（Wen et al., 2018）。
利用亲和素树脂富集并质谱分析，分别在 MCF7 与 HT29 细胞中鉴定出 78 与 43 种可能含 Sialyl-T 抗原的糖蛋白。生物信息学分析显示，这些蛋白主要富集于结合与催化活性相关功能。
尽管化学酶标记特异且高效，但受限于重组糖基转移酶与修饰糖核苷酸的可得性，其应用范围仍有限。

代谢标记（Metabolic Labeling）

代谢标记通过细胞摄取带有化学报告基团的糖类似物，使其掺入细胞表面糖蛋白中，从而实现特异分析。
细胞的糖链生物合成途径可耐受多种带化学报告基团的非天然糖类似物，如 ManNAz、GalNAz、GlcNAz。[20]
化学报告基团应具有生物正交性，即不与细胞内其他功能基团反应，以确保标记特异性。
随后通过生物正交反应（如 CuAAC、SPAAC）将亲和基团（如生物素）引入，用于富集并鉴定表面糖蛋白。

本课题组开发了一种结合代谢标记、生物正交化学和基于质谱的蛋白质组学的综合方法，用于全面且位点特异地研究细胞表面糖蛋白。[21][22][23]
在使用含叠氮基的糖类似物标记（GalNAz、GlcNAz 或 ManNAz）后，利用 DBCO-sulfo-biotin 通过 SPAAC 反应标记细胞表面糖蛋白。
由于 DBCO-sulfo-biotin 具有高度亲水性，无法穿透质膜，因此仅标记细胞表面蛋白。
裂解细胞并消化蛋白后，使用 NeutrAvidin 磁珠富集生物素化糖肽，并进行位点特异性 MS 分析。
结果显示，肽水平富集可显著减少非特异结合。比较不同糖类似物后发现，GalNAz 在表面 N-糖蛋白检测覆盖度上最高。

细胞表面糖蛋白在免疫应答中起关键作用。近期，我们结合选择性富集与多重蛋白质组学，全面定量分析了单核细胞和巨噬细胞在脂多糖（LPS）刺激下的表面糖蛋白动态变化。[24]
时间分辨定量结果揭示了表面糖蛋白的逐步或瞬时变化模式，且单核细胞与巨噬细胞的响应存在差异。

代谢标记通常局限于培养细胞，但 Spiciarich 等人[25]（2017）通过在含 ManNAz 的培养基中培养组织切片，实现了组织表面糖蛋白的代谢标记与 MS 分析。
然而，其广泛应用仍受限于不同细胞系和糖蛋白标记效率差异，这可能影响定量结果。[26]

10.1021/pr060125o
10.1038/nprot.2006.359
10.1021/pr801091k
10.1021/ac0354037
10.1021/pr700651b
10.1038/nbt827
10.1038/nbt.1532
10.1074/mcp.M112.018135
10.1371/journal.pone.0121314
10.1073/pnas.1808790115
10.1074/mcp.M116.063859
10.1038/s41467-019-13418-5
10.1093/bioinformatics/btaa092
10.1093/glycob/cws144
10.1002/anie.201702191
10.1021/acs.analchem.9b00441
10.1074/jbc.M115.700369
10.1021/jacs.6b04049
10.1021/jacs.6b07132
10.1126/science.276.5315.1125
10.1039/c5sc01124h
10.1007/s13361-014-1016-7
10.1021/acs.analchem.5b04871
10.1002/anie.202102692
10.1002/anie.201701424
10.1002/anie.200806319