分泌蛋白组学 (Secretomics) #283
困难
分泌组（secretome）蛋白在条件培养基中的浓度较低。
培养基补充物（如胎牛血清或神经元培养补充剂 B27）会引入白蛋白及其他血清蛋白，其浓度（可达 5 g/L）远高于分泌蛋白的水平（Price and Brewer, 2001）。
分泌蛋白还可能被来自破裂或凋亡细胞释放的高丰度胞质蛋白所掩盖。
以往的研究通常使用无血清或无蛋白培养条件。然而，这种方法存在显著缺陷：它会引起细胞应激，且不适用于许多细胞类型的培养，使得对原代细胞（如神经元）的分泌蛋白进行鉴定与定量几乎不可能。
M. Quadroni 等人[10.1021/pr900476b] 提出了一种策略，用于在含胎牛血清的条件培养基（CMs）中分析细胞分泌的蛋白质，该方法结合了代谢标记与蛋白质浓度线性化技术的优点。
通过将条件培养基与六肽配体文库（hexapeptide ligand library）孵育，可以降低样品的动态范围，从而识别出的蛋白质数量比未经处理的样品增加约三倍。
同时，使用氘标记氨基酸（deuterated amino acid）可以区分细胞来源的蛋白质与培养基中同源的牛源蛋白。
Jeroen Krijgsveld 等人[10.1038/nbt.2356] 结合了两种代谢脉冲标记方法：SILAC 与 AHA（azidohomoalanine）标记。
AHA 是一种携带叠氮基的甲硫氨酸类似物，对细胞进行 AHA 脉冲标记后，可通过“点击化学”选择性地、共价地捕获新合成的蛋白质，将其与炔基活化树脂偶联。
在脉冲 SILAC（pSILAC）中，两组平行的细胞分别暴露于“中等”或“重”标记的精氨酸和赖氨酸，在限定时间内培养。利用质谱可定量该时间段内产生的不同蛋白的相对含量。此外，SILAC 标签的掺入还可区分新合成蛋白与既有蛋白。
AHA 具有细胞毒性，因此必须针对每种细胞类型单独滴定至亚毒性浓度。
其原因可能是：AHA 不能完全模拟甲硫氨酸，掺入蛋白质中会轻微改变蛋白构象和功能，从而引发细胞毒性。
SPECS
Stefan F. Lichtenthaler 等人 [10.1038/emboj.2012.173] 开发了 SPECS（Secretome Protein Enrichment with Click Sugars） 方法。
SPECS 通过含叠氮基糖的代谢标记，结合无铜点击化学介导的生物素化，特异性地标记细胞内糖蛋白，而不标记血清糖蛋白。
点击化学反应为叠氮基与环张力炔（strained cycloalkyne）的生物正交[3+2]环加成反应（Jewett and Bertozzi, 2010）。我们使用了生物素化的环张力炔 DBCO-PEG12-Biotin 和 ManNAz。
SPECS 可有效富集 N-糖基化蛋白，其细胞毒性远低于 AHA 标记。
与 AHA 不同，SPECS 中的修饰糖位于蛋白质结构的外部，不太可能影响其构象。
优化 SPECS 的研究
Stefan F. Lichtenthaler [10.15252/embj.2020105693] 进一步开发了小型化的高性能版本：hiSPECS（high-performance Secretome Protein Enrichment with Click Sugars）。
ManNAz 标记后，使用 ConA 凝集素沉淀富集条件培养基中的糖蛋白，大幅去除非糖蛋白如白蛋白（图 EV1B）。
利用无铜点击化学，将叠氮糖蛋白共价捕获至磁性 DBCO-炔基磁珠，并进行严格洗涤以去除污染蛋白。
对捕获的糖蛋白进行磁珠上胰蛋白酶消化，生成肽段以供质谱无标记定量（LFQ）。
在 Q Exactive HF 质谱仪上进行 DDA 或 DIA 模式的测定。与 DDA 相比，DIA 可检测所有肽段，尤其有利于低丰度肽段的检测。
与原 SPECS 方法相比，hiSPECS 仅使用 100 万个原代小鼠神经元（细胞数减少 40 倍），但在 DDA 和 DIA 模式下，分别定量到 186% 与 236% 的糖蛋白。
DIA 模式比 DDA 多检测到 18% 的糖蛋白与 11% 的剪切跨膜蛋白，并使定量动态范围扩展近一个数量级。
此外，99.9%（2273/2276） 的单跨膜蛋白肽段映射到其已知或预测的胞外结构域，证明 hiSPECS 能可靠地识别分泌组特异性蛋白。
长期以来人们发现，使用炔基探针进行高浓度蛋白样品（例如血清）的富集时，无法有效去除高丰度的污染蛋白。Zheng等人 [10.1002/cjoc.202000752] 证明了这种蛋白污染主要是由于末端炔烃与半胱氨酸残基之间发生的硫醇-炔加成反应（thiol-yne addition）所致。通过将叠氮基富集与炔基代谢标记相结合，可以显著减少污染，并提高在含血清培养基中分泌蛋白的富集效率。
