交联质谱 (Crosslinking MS) #293
Proteome-wide XL-MS，或者称为 System-wide XL-MS。
交联多肽在质谱分析中通常很难检测，因为它们的异质性和低丰度。此外，由两个肽段组成的交联多肽会产生复杂的 MS/MS 谱图，使得它们的明确鉴定变得困难。
随着技术改进、新型商业交联剂和软件工具的出现，系统级规模研究蛋白质相互作用（PPIs）逐渐增多 [10.1021/acs.analchem.7b04431][10.1074/mcp.R116.061663]。
在细胞环境中捕获 PPIs 使得 XL-MS 在系统级别上具有很大优势。在细胞中“冻结” PPIs 可以捕获弱或短暂的相互作用，同时可以分析蛋白质的结构动态，包括识别生理相关的翻译后修饰 [10.1038/s41596-018-0074-x]。
目前，在系统性研究中鉴定的交联多肽的最大数量大约是 10,000 个 [10.1007/s00216-020-02700-x]。
系统级研究已在以下样本类型中进行：
细胞裂解液：人类细胞系、果蝇胚胎
细胞器：细胞核、线粒体和突触囊泡
组织：小鼠脑、植物、小鼠心脏
活细胞：细菌 和人类细胞
在细胞裂解之前进行交联反应的系统级实验通常被称为 in vivo XL-MS；然而，更合适的术语应该是 原位（in situ）XL-MS。
利用可切割的 MS 交联剂进行蛋白组水平实验的数据分析变得可行且更快速，减少了搜索空间，并由于在质谱仪中断裂过程中形成特征离子，使交联肽的准确分配更加精确。与使用不可切割的交联剂相比，这些特性可以显著增加在复杂混合物中鉴定到的交联肽的产量。然而，新的分析策略和数据分析软件工具也不断改进了使用不可切割交联剂的 XL-MS 实验结果。
系统性研究的主要限制在于互作组覆盖的深度较小，受以下因素限制：
细胞环境中蛋白质及其结合亲和力的高动态范围
可以被交联剂靶向的氨基酸
交联蛋白复合物的溶解度降低，在消化协议中带来挑战
大型交联产物的电离效率降低
在进行蛋白质组范围的 XL-MS 实验时，最大的挑战之一是对高丰度蛋白质的偏好性。最近的一项研究通过使用体外模拟拥挤的细胞环境和真核细胞裂解液增加了低丰度蛋白质的检测。这强调了开发反映系统范围内蛋白质-蛋白质相互作用的 XL-MS 协议的重要性，以全面、接近原位的方式进行。
Reducing sample complexity
在系统级研究中，降低交联样品的复杂性 是一个重要方面。其目的是提高交联肽的鉴定速度和准确性，因为与消化混合物中的非交联线性肽相比，交联肽通常丰度较低 [10.1021/acs.analchem.7b04431]。
降低复杂性可以通过两种方式实现：
在酶解之前对感兴趣的蛋白质或细胞器进行富集
在肽段水平进行富集
在体内交联反应“冻结”了细胞内的相互作用和构象后，可以通过亲和纯化实验针对特定蛋白质 [10.1074/mcp.M116.065326] 或药物 [10.1021/acs.analchem.0c03128] 富集细胞裂解液。这种富集方法可以研究特定相互作用网络及其三维结构组织。
对于更全面的细胞或亚细胞相互作用组学研究，可以通过预分离富集裂解液中的所有交联肽。该方法利用了交联肽与线性肽的特定物理化学差异：
尺寸排除色谱法（SEC）：交联肽由于分子量（准确地说是斯托克斯半径）更大，比线性肽更早洗脱 [10.1021/acs.analchem.9b02372][10.1074/mcp.M111.014126]
强阳离子交换（SCX）色谱法：交联肽由于更多正电荷而被保留。阳离子交联剂 [10.1007/s13361-011-0288-4] 以及在交联后保留赖氨酸正电荷的交联剂 [10.1007/s13361-017-1744-6] 特别有利于基于电荷的富集
这些分级方法的分辨率有限，并显著增加了下游 LC/MS 分析时间。
另一种富集交联肽的可能方法是使用具有富集标签的交联剂，例如 azide- 和 alkyne-DSBSO、PhoX 和 PIR。在肽水平上的 SEC 分级可提高后续亲和纯化步骤的效率，去除大多数“dead-end”交联，即被部分水解的交联剂修饰的肽，这些肽可能饱和亲和固定相 [10.1021/acs.analchem.7b04431]。
交联剂
在进行体内 XL-MS 实验之前，对交联剂进行仔细选择是必要的。
交联剂的反应基团会影响所得到的交联分布和数量。处理系统级 XL-MS 研究中巨大样本复杂性的一种途径是在交联剂本身嵌入一个独特的签名，例如同位素标记或质谱易裂解基团，在串联质谱中产生特征性签名。
在设计 in vivo XL-MS 实验时，需要考虑交联剂的**透膜性（Membrane permeability）**和整体大小，特别是当交联剂上存在亲和性手柄时。这些分子特性会影响其在细胞内的扩散和蛋白质界面的相互作用 [10.1016/j.cels.2018.01.005]。
替代方案是将含有 benzophenones、diazirines 或 azido 基团的光活性氨基酸直接嵌入蛋白质中，可通过遗传工程利用琥珀终止密码子精确引入特定位置 [10.1038/nrm2005]。非天然氨基酸可以在核糖体翻译过程中嵌入蛋白质序列，而不改变蛋白质整体结构。
已报道的系统性 XL-MS 成果：
Bruce 小组：在体内线粒体中鉴定 2,427 个独特交联肽对 [10.1073/pnas.1617220114]
Heck 小组：3,322 个独特残基对 [10.1074/mcp.RA117.000470]
Rappsilber 小组：同一细胞器中 5,518 个残基对 [10.1021/acs.jproteome.9b00541]
Sinz 小组：果蝇胚胎中 7,436 个独特交联 [10.1021/acs.analchem.9b02372]
Yu 小组：人类细胞裂解物中 9,319 个独特交联 [10.1038/s41592-020-0959-9]
多种交联剂联合使用可增加鉴定深度。例如，Low 实验室使用 DSSO、DHSO 和 DMTMM 的组合 XL-MS 方法鉴定 2,110 个 PPIs [10.1073/pnas.2219418120]。
然而，在系统水平 XL-MS 实验中，不同研究结果难以比较，因此必须特别注意假阳性发现率（FDR）的计算和数据报告。科学界尚未对 XL-MS 的命名法、实验方案和报告格式达成共识。
系统范围 XL-MS 实验几乎都使用胺基反应交联剂（Amine-reactive crosslinker）。与胺基反应可能导致结构信息丢失，因为交联后蛋白质可能变得不易溶解，降低酶消化效率。修饰赖氨酸的 ε-胺基团会使交联位点的胰蛋白酶消化失活，这可能导致大型交联肽难以通过 ESI-MS 分析。应用互补消化酶（如 AspN、GluC）与胰蛋白酶，可帮助识别交联位点，并增强交联识别的信心。
