交联质谱 (Crosslinking MS) #293
定量交联质谱 (Quantitative XL-MS, QXL-MS）是一种整合结构生物学方法，适用于系统级分析。
通过定量分析交联产物无偏地比较蛋白质在不同条件下的构象变化，可了解溶液中蛋白质的结构和相互作用动态。
QXL-MS的主要瓶颈仍然是缺乏处理 XL-MS 数据并以自动化方式推断定量信息的生物信息学工具，尤其对于可被质谱裂解的交联剂而言。如今，可以利用不同策略获取 QXL-MS 数据，例如：
同位素标记 QXL-MS
同位素标记的 QXL-MS 依赖于同一个交联剂的“轻”与“重”形式组合，其中几个原子被稳定重同位素取代。每个样品与一种交联剂物种交联，然后以 1:1 的比例混合。随后代表不同条件的样品被消化，并通过质谱分析，根据质谱信号强度对交联强度进行定量。
例如，在胺反应交联剂的交叉桥（cross-bridge）结构的两个碳上修饰两对氘原子，可使其分子量增加 4 amu。
重同位素试剂：BS2G-d4、BS3-d4
轻同位素试剂：BS2G-d0、BS3-d0
这四种化合物的 sulfo-NHS 酯均能与蛋白质上的胺基形成酰胺键，几乎没有化学性质或反应性的差异。通过重/轻交联剂对蛋白质进行偶联，可以在质谱中获得具有唯一原子质量单位（amu）的衍生物。
| Reagent | Both Ends Amide Bond Linked | One End Hydrolyzed to Carboxylate |
|---|
| BS3-d0 | 138.068 amu | 157.079 amu |
| BS3-d4 | 142.090 amu | 161.102 amu |
| BS2G-d0 | 98.102 amu | 116.113 amu |
| BS2G-d4 | 102.124 amu | 120.135 amu |
最初的同位素标记 XL-MS 比较实验使用非可裂解的 BS3 交联剂，以 D0（轻）和 D4（重）形式 1:1 混合 [10.1038/ncomms2985][10.1016/j.jprot.2013.03.005]。该研究首次引入了专门用于同位素标记交联肽定量的自动化软件。
软件工具与数据分析
从那时起，许多 QXL-MS 软件工具相继开发或整合，大多针对非可裂解交联剂 [10.1016/j.cbpa.2021.06.011]。对于可质谱裂解的交联剂，生物信息学资源仍然不足，因此在系统级研究中应用 QXL-MS 仍受限制。
第一个使用质谱可裂解交联剂进行大规模系统性 QXL-MS 的研究是使用 PIRs 的原理验证实验。在该研究中，同位素标记 PIRs 用于体内交联两个 E. coli 生物体，交联肽定量率约为 78% [10.1021/acs.jproteome.6b00752]。
另一种基于同位素标记的方法是代谢标记（SILAC）。Chavez 等人使用这种方法分析了耐药癌细胞与敏感癌细胞之间蛋白质相互作用的变化 [10.1038/ncomms8928]。研究表明，通过 SILAC 定量可区分 PPIs 中的调控变化，因为特定交联肽的变化与蛋白质丰度变化不一致。
TMT 标记 QXL-MS
另一种定量方法是同位素标记（如 TMT 标记），允许在单次 MS/MS 运行中进行多重相对定量。TMT 标记在肽水平上进行，因此样品在 MS 分析前独立准备，直到最后一步才混合。这可能引入样品间差异。
Huang 研究组提出了等比例 QXL-MS 的 QMIX 工作流程 [10.1021/acs.analchem.6b03148]：
使用 MS 可裂解交联剂 DSSO
结合双联 TMT 试剂
在 MS3 水平对异构标记交联肽进行定量
iqPIR 策略
最近引入了一种新策略，将等比例标记交联剂与“等比例定量蛋白质相互作用报告者”（iqPIR）工具结合 [10.1021/acs.analchem.0c03128]：
无标记定量（LFQ）
无标记定量（LFQ）是最常用的 QXL-MS 策略之一，因为无需额外试剂。然而，交联肽丰度低，导致 LFQ 的信号重复性差，尤其在复杂混合物中。针对性分析方法（如并行反应监测）可改善结果并减小样品大小 [10.1371/journal.pone.0167547][10.1016/j.tibs.2018.09.003][10.1038/s41596-018-0089-3]。
数据采集模式
新型 QXL-MS 工作流整合不同软件，以提高鉴定和定量准确性 [10.1007/s13361-017-1837-2]。DIA 应用于 LFQ 与 DDA 相比，具有更好重复性和更大样品分析能力 [10.1074/mcp.TIR118.001276]。
交联产物富集可降低 MS 分析的动态范围，提高定量分析的特异性、灵敏度、准确性和重复性，从而更深入地阐明蛋白质的构象变化和相互作用动力学。
