交联质谱 (Crosslinking MS) #293
XL-MS方法已经在结构生物学中被广泛接受。
与其他[蛋白质结构分析]方法相比，交联质谱（XL-MS）方法的优势是可以研究膜蛋白、具有翻译后修饰的蛋白质以及剪接变体。XL-MS与其他结构技术（如HDX-MS或cryo-EM）结合使用时，为提供蛋白质及蛋白质复合物的三维结构信息提供了巨大潜力。
由于交联反应可以在原位环境中进行，交联可以反映蛋白质或蛋白质组装的天然构象。
在21世纪初，XL-MS主要局限于单个蛋白质或较小蛋白质复合物的分析。
过去20年中，XL-MS能够分析的蛋白质复合物的分子量不断增加，现在可以对大小高达百万道尔顿的蛋白质复合物进行结构分析。
从2000年开始，第一个基于XL-MS方法报道的蛋白质三维结构问世 [10.1073/pnas.090099097][10.1110/ps.9.1503][10.1021/ac991081o][10.1021/bi010259+]。
在这个早期阶段，已经明显看出，要明确地鉴定交联，需要确定交联产物的精确质量，并且需要MS/MS方法的支持。
为了促进对交联产物的明确指定，已经开发了几种策略来实现这一目标。
为了区分交联物种与其他“不那么引人注目”的信号，已经开发了几种策略来区分交联产物。
使用氘代交联试剂可以在质谱中检测到非氘代（“轻型”）和氘代（“重型”）交联试剂的等摩尔混合物中的潜在交联 [10.1021/ac001379a]。
该策略基于质谱图中的特征同位素模式和质量偏移，这些模式和偏移是由于轻型和重型交联试剂的1:1混合物导致的，用于交联鉴定。
这种方法迅速被其他人采用，并仍然是简化交联产物质谱鉴定的常用策略。
迄今为止，在非氘代交联试剂混合物中使用4倍到12倍氘代交联试剂仍然是促进交联鉴定最常用的策略之一。
使用氘代交联试剂时，必须考虑反相液相色谱中氘代和非氘代物种之间保留时间的差异（长达45秒）。
通过比较同位素标记的交联肽对，可以使用xQuest从大型数据库中识别交联（图4） [10.1038/nmeth.1192]。
图4. 使用同位素编码交联试剂和xQuest从MS/MS谱中识别交联肽段的过程。同位素肽对的轻和重形式在前体离子谱图（MS）中被检测并进行单独的MS/MS测序。
图5. MIX技术应用于同源二聚体蛋白（IL-6D）的示意图 [10.1074/jbc.M207370200]。
由几个相同亚基组成的蛋白质使分析更加复杂，因为很难区分分子内和分子间的交联。在这种实验情况下，可以应用所谓的“MIX”方法（混合同位素交联）。
在1:1的化学计量比例下，将同位素（15N）标记的蛋白质与非标记（14N）蛋白质混合，得到的交联肽段可以不带标记（14N/14N）、带有混合标记（14N/15N）或均匀同位素标记（15N/15N）。
混合标记的存在表示存在分子间交联。
Integrative Structural Biology
在结构生物学领域，如今广泛认可的一种方法是整合互补的技术，包括低分辨率和中分辨率技术，这是理解生物复合物及其功能的有效途径。
这个研究领域向着多学科的三维结构分析高度具有挑战性的生物分子靠拢，被称为“integrative structural biology”（整合结构生物学）。
近年来，整合结构生物学已经向数据驱动的建模方法发展 [10.1021/ja026939x]，利用任何实验信息来源来理解蛋白质复合物在其天然环境中的结构。
结构质谱的各种方法已经证明能够产生有价值且易于整合的数据，用于推断或优化蛋白质和蛋白质组装的三维结构模型。
这体现在越来越多的发表论文中，其中两种或多种基于质谱的技术与计算建模和其他低分辨率及中分辨率方法进行整合，其中XL-MS是主要方法之一。
整合结构生物学在研究全长的“难处理”蛋白质（如膜蛋白或无序蛋白质）方面展示了其实力。通常，这些蛋白质的结构和功能特性是通过使用截短形式进行表征的。
利用XL-MS对p53肿瘤抑制因子（无序蛋白质含量约为43%）进行表征 [10.1002/anie.201609826]。
最近提出了一个模型，将包括XL-MS、HDX-MS和SAXS在内的不同低分辨率技术与Rosetta对接研究相结合，研究肝脏受体同源物1（LRH-1） [10.1016/j.str.2020.04.020]。
得到的模型表明，在LRH-1与DNA和辅激活肽形成复合物时，单体LRH-1的结构和功能受到多个域间相互作用的调控。
XL-MS和HDX-MS是两种高度协调的结构质谱技术。
在一项综合研究中，XL-MS和HDX被用于将卵磷脂：胆固醇酰基转移酶和高密度脂蛋白ApoA-1的X射线结构对接到负染电子显微镜获得的低分辨率三维密度图中。
XL-MS和HDX数据提供了两种蛋白质结构的定位信息，而电子显微镜提供了组装体的整体形状。通过整合不同的低分辨率结构方法，获得了对该高度动态复合物的见解 [10.1038/s42003-019-0749-z]。
Conformational Heterogeneity in Protein Assemblies
XL-MS在蛋白质组装的结构表征中对结构异质性和构象变化的评估至关重要。
蛋白质复合物在不同时间尺度上表现出动态性，甚至在配体结合或解离时可能表现出无序到有序的转变。XL-MS捕获了亚复合物的多种状态，并提供了结构集合的三维坐标，而不仅仅是单个平均结构 [10.1016/j.jmb.2015.07.016]。
最近使用三种具有不同化学特性的可切割交联剂评估了[蛋白质COP9信号体]的构象动态性。
COP9是一个由八个亚基组成的复合物，与最近发现的结合亚基CSN9相互作用，并参与蛋白质泛素化控制。
数据表明蛋白间交联存在差异，显示了COP9信号体整体结构的可塑性 [10.1073/pnas.1915542117]。
Studying Molecular Machines
大型功能性蛋白质组装体（“分子机器”）通常具有兆道尔顿级大小，非常复杂、异质、瞬时组装并动态变化。
例子包括：SARS-CoV-2刺突蛋白 [10.1126/science.abd5223]、蛋白酶体 [10.1016/j.celrep.2018.07.004]、tRNA聚合酶II [10.1126/science.1238724]、胞吐复合物 [10.1002/pro.3863]、脂肪酸合成酶 [10.15252/msb.20167412]、纤维蛋白凝块 [10.1073/pnas.1911785117]、Smc5/6复合物 [10.1073/pnas.2026844118]、类型III-B CRISPR-Cas复合物 [10.1016/j.molcel.2014.09.002]、丙酮酸脱氢酶复合物 [10.1016/j.celrep.2021.108727]、核孔复合物（NPC） [10.1016/j.cell.2013.10.055]。
整合结构生物学提供了关于NPC组织、组成异质性和内在动态性的多个方面的答案 [10.1038/s41586-020-2670-5][10.1126/science.aaf0643][10.1038/nature26003]。
Combining XL-MS and Cryo-EM
获得蛋白质复合物的整合模型通常需要冷冻电镜map（单颗粒或断层）或其他互补结构方法（如SAXS/SANS），以提供总体积和形状信息 [10.1016/j.febslet.2015.08.027]。
由于高度复杂结构冷冻电镜地图的低分辨率，蛋白质组分可能放置在多个位置。加入XL-MS数据可以显著减少这种不确定性。
XL-MS数据允许在低分辨率下对特定区域进行局部建模 [10.1073/pnas.2005301117]。
通过结合XL-MS和自顶向下质谱分析，可解析PSII-LHCII超复合物的结构 [10.1038/s41467-020-15184-1]。
冷冻电子断层摄影术与XL-MS结合可重建NPC，提供前所未有的精度 [10.1016/j.cell.2013.10.055]。
整合建模的例子
核小体泛素化和染色质重塑
通过NMR光谱、XL-MS、突变和数据驱动建模，发现E3连接酶结合在核小体表面的酸性区域，引导E2酶靶向特定赖氨酸进行泛素化 [10.1038/s41467-019-09756-z][10.1016/j.cell.2020.09.051]。
范可尼贫血途径修复DNA损伤
通过冷冻电镜结合XL-MS和Rosetta分配了5182个氨基酸，显著提高了结构解析度 [10.1038/s41586-019-1703-4]。
囊泡和货物运输
BBSome复合物结构通过Rosetta建模结合冷冻电镜地图和XL-MS解析 [10.1016/j.str.2019.06.006][10.1038/s41594-017-0016-2]。
Figure 14. BBSome亚基与Cryo-EM密度的手动匹配 [10.1016/j.str.2019.06.006]。
丙酮酸氧化
整合XL-MS、冷冻电子断层摄影及建模方法构建了PDHc的3D反应模型 [10.1016/j.celrep.2021.108727][10.1042/EBC20180008][10.1016/j.jmb.2015.09.014][10.1002/jcc.20084][10.1107/S2059798319011471]。
转录-翻译耦合
在肺炎支原体中使用DSS和DSSO进行细胞内交联，结合冷冻电子断层摄影生成超复合物的重建图像 [10.1007/978-1-4939-9608-7_15]。
细胞核质转运
酿酒酵母模型揭示以前未观察到的构象变化，并整合XL-MS数据 [10.1038/s41586-020-2670-5][10.1038/nature26003][10.1002/jcc.20084][10.1007/978-1-4939-9608-7_15]。
应用
