内在无序蛋白质（IDPs）与内在无序区域（IDRs）的结构质谱分析
对 内在无序蛋白质（IDPs）和 内在无序区域（intrinsically disordered regions, IDRs）的分析是一个迅速发展的研究领域。
真核生物中，约有 30% 的蛋白质缺乏部分定义和稳定的二级或三级结构 [10.1007/s00018-014-1661-9]。
这些 IDPs 和 IDRs 呈现高度动态的多种构象集合。
IDPs 通常在许多细胞功能中发挥关键作用，包括信号传导、酶活性调控和转录，其中构象可塑性带来了许多优势。
尽管关于其结构相关的作用机制了解甚少，但 IDPs 和 IDRs 通常与疾病状态相关联，因此成为有吸引力的药物靶点。
IDPs 的固有灵活性对于使用传统生物物理方法进行 3D 结构研究提出了重大挑战。
要全面了解 IDPs 的结构、动态和相互作用，必须整合多种方法论来获取广泛的结构信息。
非变性质谱（Native MS）与离子迁移质谱（IM-MS）
非变性质谱（Native MS）和 离子迁移质谱（IM-MS）可以提供溶液中蛋白质构象、构象转变以及无序性的信息。
研究已证明蛋白质平均电荷状态和表面积之间存在相关性 [10.1021/ac050511+]。
Native MS
通过非变性质谱记录的电荷状态分布的高斯形状以及由此得出的表面积（SASA），已发现与蛋白质的结构直接相关：
稳定折叠的蛋白质的电荷状态分布比无结构的蛋白质更紧凑 [10.1002/biot.200800250] [10.1007/s13361-016-1490-1] [10.1002/pmic.201800060]。
IM-MS
离子迁移质谱记录的碰撞截面（CCS）与蛋白质或蛋白质复合物的结构紧凑性之间也存在直接相关性 [10.1016/j.cbpa.2018.01.007]。
离子迁移质谱与交联质谱相结合，可以在高度复杂的环境中更深度、更灵敏地鉴定交联位点 [10.1021/acs.analchem.1c01317] [10.1074/mcp.RA120.002094] [10.1021/acs.analchem.0c01273]，为技术组合的另一个成功应用铺平了道路。
结合离子迁移质谱和交联质谱来分析 IDPs 的全部潜力有待进一步发掘。
氢氘交换质谱（HDX-MS）
氢氘交换质谱（HDX-MS）是结构质谱中的另一种工具，已被广泛应用于研究蛋白质中的无序程度。
它通过监测蛋白质在溶液中与 D₂O 溶剂中氢原子交换为氘原子的速率，从溶液中记录蛋白质的酰胺骨架的溶剂可及性（SASA）变化，并通过质谱仪在时间上进行记录 [10.1002/pro.5560060517] [10.1002/9781118703748]。
因此，HDX-MS 可以提供有关溶剂可及性、二级和三级结构、构象变化、蛋白质状态和结合界面的信息。
HDX-MS 能够捕获蛋白质或蛋白质复合物在溶液中的动态变化和变构调控，因此它是一种具有单个氨基酸分辨率的局部构象传感器（local sensor） [10.3390/life10110286]。
HDX-MS 方法也被用于研究 IDPs 和 IDRs 在蛋白质-蛋白质及蛋白质-配体结合后的构象动态和结构转变 [10.3389/fchem.2021.603639] [10.1002/9781118703748]。
例如，HDX-MS 已被用于研究微管相关蛋白 tau 蛋白 的全长构象变化：当其从单体转变为可溶性聚集体时，这种构象变化在致病性神经退行性过程中的纤维形成之前发生。
研究表明，在聚集体中，tau 蛋白的四个重复序列之一 R3 得到稳定，而 N- 和 C- 端区域与单体中一样暴露于溶剂中。
这一发现表明，R3 区域对 tau 蛋白向可溶性聚集体的转变起重要作用。
交联质谱（CL-MS / XL-MS）
通过 XL-MS 研究了 native tau 蛋白和两种 Pro-301 变体的单体结构 [10.1038/s41467-019-10355-1]。
这些突变已知会增加蛋白质的聚集倾向和纤维形成，这两者都与神经退行性相关。
数据表明，这些与微管结合重复区域靠近的突变进一步不稳定了重复结构中的亚稳态结构，导致淀粉样区域 R3 的暴露。
此外，无序区域通常富含赖氨酸和精氨酸残基，因此适合进行 XL-MS 研究。
因此，XL-MS 在解释 IDPs 和 IDRs 的结构方面越来越重要。
最近的一个例子是对生长素信号传导的分析，其中 XL-MS 允许针对生长素感知复合物的有序区域和无序区域进行定位 [10.1038/s41467-020-16147-2]。
这项研究旨在定义 IDRs 所达到的构象空间，并指导实验设计以确定生长素感知中关键残基和序列。
一般来说，XL-MS 数据反映了交联反应特定时刻溶液中存在的构象混合物，包括不稳定和瞬态的种群。
通过这个快照获得的距离约束可以用于建模 IDPs/IDRs。
采用这种方法，可以研究由于氨基酸序列突变、后转录修饰和与蛋白质及其他配体相互作用引起的构象变化。
与此同时，将 XL-MS 与非变性质谱有效组合，可分离完整的交联亚种群。
这一卓越组合已被用于研究全长野生型转录因子 p53 的单体和同源四聚体 [10.1002/anie.201609826]。
该 IDP 是著名的肿瘤抑制剂。
在该研究中，将 ¹⁵N（“重”）和 ¹⁴N（“轻”）的 p53 以 1:1 比例混合，以区分分子内和分子间交联。
在 DNA 存在和不存在的情况下进行了交联，确认形成的同源四聚体是由二聚体的二聚化引起的。
图 (a) 在 DNA 存在下的 p53 ESI 质谱图，使用逐渐增加摩尔过量的 DSBU 交联剂（UXL）进行交联。
(b) 放大谱区，显示 p53 二聚体和分子伴侣 DnaK 的信号。
(c) 放大谱区，显示 p53 四聚体的信号。
谱图在醋酸铵缓冲溶液中使用高质量 Q-TOF 质谱仪记录，所有设置相同。
这些蛋白质的另一个重要方面是，由于 IDP 和 IDR 的结构灵活性，它们可以与多种潜在的蛋白质相互作用伴侣结合，因此成为 PPI 网络中的理想枢纽 [10.1111/j.1742-4658.2005.04948.x]。
XL-MS 是一种能够捕获这些多种非共价相互作用的技术，同时提供结合界面和结合后构象变化的结构信息。
最后，XL-MS 有潜力通过 体内交联 揭示拥挤的细胞内环境对 IDP/IDR 的影响 [10.1021/cr400695p]。
这些 XL-MS 特点与其他基于质谱的结构工具相结合，将有助于揭示迄今为止未被结构研究所了解的细胞“暗蛋白质” [10.1016/bs.mie.2018.09.038]。
