肽段鉴定软件的核心是评分函数（scoring function），用于评估肽段（理论计算谱图）与实际二级质谱图的匹配程度。
对于原始数据中的每个二级谱，软件会检索蛋白质数据库，以找到评分最高的匹配项（peptide-spectrum matching, PSM）。
然而，PSM 并不总是真实的。导致错误匹配的常见原因包括：
二级谱质量较低；
目标肽段不在数据库中；
评分函数不完善。
为了控制结果质量，PSM 通常按得分排序。通过选择合适的得分阈值（score threshold），可以保证阈值以上的 PSM 具有可接受的质量。
FDR（False Discovery Rate, 假发现率） 被定义为：阈值以上的假阳性 PSM 数量与总 PSM 数量的比值。
通过调整得分阈值，可以在结果的准确性（FDR）与灵敏度（识别数量）之间进行权衡。不同软件由于评分函数不同，其权衡效率可能差异显著。
值得注意的是，大多数蛋白质鉴定结果列表中的假阳性比例高于 5%，即使采用了 p < 0.05 或 95% 置信度的截断值。
使用 Target-Decoy 方法估计 FDR
在实际应用中，难以直接判断哪些 PSM 是假阳性的——否则算法可以直接将其去除，从而实现零假发现率。
因此，靶标-诱饵（Target-Decoy）方法在实践中被广泛用于估算 FDR。
在这种方法中，软件会同时搜索一个**靶标数据库（target database）与一个诱饵数据库（decoy database）**的拼接版本，且两者大小相同。
如果诱饵库构建合理，则软件产生的假阳性鉴定将在靶标库与诱饵库中均匀分布。由于所有诱饵匹配结果都是假阳性的，因此可用以下公式估算 FDR：
\text{FDR} = \frac{\#(\text{Decoy Hits})}{\#(\text{Target Hits})}
在实验中，诱饵数据库通常通过将真实数据库逆序或随机打乱生成，因此不包含任何真实序列。使用诱饵数据库得到的匹配结果必为假阳性 [10.1038/nmeth1019]。
基于诱饵匹配的 FDR 计算方法
目前至少存在两种基于诱饵匹配的 FDR 计算方法。最常用的一种称为 全局假发现率（Global False Discovery Rate, 亦称 Aggregate FDR），其计算公式为：
\text{FDR} = 100 \times \frac{2 \times (\text{诱饵匹配数})}{\text{总匹配数}}
（计算时适用于任意选定的得分阈值）
示例：
如果在得分 50–400 范围内共有 200 个蛋白匹配，其中 4 个为诱饵匹配，则
\text{FDR} = \frac{2 \times 4}{200} \times 100 = 4\%
Global FDR 的局限在于：这 4% 的 FDR 是针对整体 200 个蛋白而言的。显然，得分在 50–80 的蛋白比得分高的蛋白更可能是假阳性。
因此可以推断，如果整体假阳性概率为 5%，则高得分蛋白的假阳性概率远低于 5%，而低得分蛋白的假阳性概率远高于 5%。
局部 FDR（Local FDR）
2008 年 Tang 等人发表了 Proteomics System Performance Evaluation Pipeline (PSPEP) 算法 [10.1021/pr070492f]，可计算每个单独蛋白的局部假发现率（Local FDR，亦称瞬时 FDR / Instantaneous FDR）。
相较于 Global FDR，Local FDR 更为严格：在相同阈值条件下（例如 FDR < 5%），满足条件的蛋白或肽段数量会更少，但置信度更高。
Target-Decoy 方法的常见误用
错误 1
在多轮搜索（multi-round search）算法中使用 Target-Decoy 验证。
多轮搜索为加速计算，常在第一轮从大型数据库中筛选出少量候选蛋白，然后在第二轮仅用候选蛋白进行匹配。
但此过程破坏了 Target-Decoy 方法的前提：第二轮中靶标库与诱饵库不再等大，从而使 FDR 估计失效。
错误 2
在评分函数中使用蛋白水平信息时仍用 Target-Decoy 验证。
若某蛋白已被高置信度鉴定，则其对应的肽段匹配更可能是真实的。
一些软件会因此给来自高置信度蛋白的肽段附加额外得分（score bonus）。
虽然这样可提高灵敏度，但会导致错误分布不均——高得分的假阳性主要出现在靶标库中，而诱饵库中较少，进而使 FDR 低估。
错误 3
使用靶标和诱饵结果重新训练评分函数并重新排序（re-ranking）。
这种重新排序方法近年来越来越常见，因为它能显著提升搜索灵敏度。
但若重新训练算法过度拟合，可能消除所有诱饵匹配（但未能去除假阳性靶标匹配），从而使 FDR 估计完全失效。
因此，仅在算法特别设计以避免过拟合，且数据集规模足够大时，才建议使用此策略。
更多关于这些常见错误的解释，可参考 A Practical Guide to Significantly Improving Peptide Identification Sensitivity and Accuracy 一文。
