【预备知识】
- 糖基化在生物体中普遍存在 #92
在ER 和高尔基体内的糖基转移酶和加工糖苷酶已被充分研究，它们的位置有助于定义 ER–高尔基体途径的各种功能隔室。
许多高尔基体酶共享相似的拓扑结构
尽管不同的糖基转移酶家族之间缺乏序列同源性，但大多数高尔基体酶共享一些特征。对脊椎动物糖基转移酶的早期研究发现，其中一些活性以可溶性形式存在于分泌物和体液中；其他则被鉴定为细胞内的膜结合活性，有些则同时表现出这两种特性。随后的分子克隆确定了高尔基体糖基转移酶的序列，揭示它们共享一个共同的拓扑结构和结构域结构，这可以解释这些观察结果。
大多数高尔基体糖基化酶是 II 型膜蛋白，由三部分组成：
一个氨基末端细胞质尾部；
一个跨膜 (TM) 区域，该区域也充当不可切割的信号序列；
一个大型羧基末端区域，包含一个靠近膜的、对蛋白水解敏感的茎区以及一个大型催化结构域。
这些高尔基体酶的 II 型拓扑结构将其催化序列置于高尔基体内腔中，在那里它们在蛋白质和脂质通过分泌途径转运期间参与聚糖链的合成。
图 Essentials of Glycobiology, 4E. Fig. 4.2. 高尔基体糖基化酶的拓扑结构和定位。
高尔基体糖基转移酶和糖苷酶是 II 型膜蛋白，其催化序列面向高尔基体内腔。根据囊泡成熟模型的高尔基体内运输，这些糖基化酶通过 COPI （coat protein I）包被囊泡中的连续逆行运输，被维持在高尔基体中并分离到不同的囊腔中。它们被掺入这些囊泡中可能是由其细胞质尾部序列与包被囊泡相关的蛋白质之间的相互作用介导的。
例如，已证明两个特定的 COPI 被膜蛋白亚基结合到许多高尔基体糖基化酶氨基末端细胞质尾部的特定序列基序上。修饰溶酶体酶的 GlcNAc-1-磷酸转移酶中该基序的突变会导致其错误定位，从而导致溶酶体贮积病——黏脂贮积症 III 型。
糖基化酶的选择性分配到膜中也在其高尔基体定位中发挥作用。跨膜 (TM) 长度和疏水性的差异允许这些酶选择性地分配到胆固醇含量低（更薄的膜）或胆固醇含量高（更宽的膜）的不同隔室中。通常，这些酶相对较短的 TM 区域可能会阻止它们分配到后高尔基体运输隔室中，这些隔室共享在细胞表面发现的更宽、富含胆固醇的膜。
高尔基体糖基化酶的二聚化和异源寡聚化，由其腔内序列介导，对于某些途径的酶定位和高效糖基化也可能很重要。这些酶的高尔基体定位并非总是绝对的，有些酶被发现位于细胞表面，或者在高尔基体晚期或后高尔基体隔室中被蛋白酶在其对蛋白水解敏感的茎区内切割并分泌到细胞外空间（未显示）。(IC) 中间隔室；(TGN) 反式高尔基网络。
许多高尔基体酶被细胞分泌，有时量很大，可以在细胞培养上清液和各种体液中发现。这些可溶性的分泌酶是通过一个或多个蛋白水解切割事件（发生在酶的茎区内）从其膜相关形式衍生而来的。这些切割事件由高尔基体反式区域和后高尔基体隔室中的蛋白酶催化。在炎症条件下，肝细胞和内皮等细胞类型产生的可溶性酶可以显著上调。
由于循环中和细胞表面定位的糖基转移酶预计无法获得足够浓度的供体核苷酸糖（主要位于细胞内部），因此曾认为它们在细胞外空间中功能上无法执行转移反应。然而，最近的证据表明，活化血小板释放核苷酸糖供体可能允许可溶性分泌的唾液酸转移酶 ST6Gal−I 修饰细胞表面上超出该酶原始来源的聚糖。
并非所有分泌途径中的糖基化酶都是 II 型膜蛋白。例如，UDP−GlcNAc: 溶酶体酶 N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶 (GlcNAc-磷酸转移酶) 是一个多亚基复合物，而 GlcNAc-1-磷酸二酯 α-N-乙酰葡糖胺苷酶 是一个 I 型膜蛋白，其氨基末端位于高尔基体内腔中。这些酶参与新合成溶酶体水解酶 Man−6−P 靶向信号的合成。
一些 ER 糖基化酶是作为可溶性蛋白质合成的。其中包括参与 ER 质量控制的 UDP-葡萄糖糖蛋白葡萄糖基转移酶 (UGGT)，以及参与表皮生长因子 (EGF) 重复序列或血小板反应蛋白 1 型重复序列 (TSR) 糖基化的酶，例如两种蛋白质 O-岩藻糖基转移酶 POFUT1（EGF-样重复序列）和 2 (TSR)，蛋白质 O-葡萄糖基转移酶 1、2 和 3 (POGLUT1−3；EGF-样重复序列），EGF 特异性 O-GlcNAc 转移酶 (EOGT；EGF-样重复序列），以及 β1→3-葡萄糖基转移酶 (B3GLCT；TSR)。此外，参与硫酸乙酰肝素合成的硫基转移酶之一——GlcNAc 3-O-硫基转移酶 1，是高尔基体中的一种可溶性酶。
高尔基体隔室中糖基化酶的定位
分泌途径中的所有糖基化形式都是高度有序和连续的过程，通常涉及糖基转移酶反应。这些酶、它们的聚糖底物（附着在蛋白质或脂质上）和适当的核苷酸糖供体必须位于同一隔室中。
生化和超微结构研究表明，糖基转移酶在分泌途径内分离到不同的重叠隔室中。一般来说，在生物合成途径早期起作用的酶定位于顺式 (cis)- 和中间 (medial)-高尔基体隔室，而在途径后期起作用的酶倾向于定位于反式 (trans)-高尔基体囊腔和 TGN。
这些观察结果促使人们对糖基转移酶和加工糖苷酶实现这种隔室分离的机制进行了广泛探索。早期研究旨在根据蛋白质运输的囊泡运输模型确定酶保留在高尔基体囊腔所需的序列，而最近的研究已纳入囊腔成熟模型的框架。
关于蛋白质如何穿过高尔基体堆叠以及高尔基体酶如何“保留”其在高尔基体囊腔中相对位置的观点已发生了重大演变，包括上述两种主要模型，它们并非相互排斥，并且可能在细胞中协同作用。
囊泡运输模型假定高尔基体是一个稳定的隔室，并且货物蛋白质以有向的方式在包被囊泡中从 ER 运输到中间隔室以及每个高尔基体囊腔之间，在此期间这些蛋白质被保留在每个囊腔中的高尔基体糖基化酶修饰。
最近的数据支持囊腔成熟模型，该模型可以解释较大的货物分子（不能装入小的运输囊泡）的高尔基体内运输（图 4.2）。在该模型中，一个新的高尔基体囊腔是在堆叠的顺式面上形成的，通过货物分子在 COPII 包被囊泡中从 ER 运输到中间隔室，以及顺式高尔基体酶在 COPI 包被囊泡中从一个“较旧”的顺式囊腔逆行运输到新形成的隔室中，然后该隔室成为顺式囊腔。随着后来的高尔基体糖基化酶依次运输到“较年轻”的囊腔中，囊腔及其货物逐渐成熟。囊腔进展并成熟，直到它们在 TGN 阶段有效地溶解，因为膜和货物被运输到质膜用于驻留或组成型分泌、运输到分泌颗粒用于调节性分泌，或运输到内体/溶酶体系统。因此，囊腔成熟模型与囊泡运输模型不同，在于高尔基体酶不是保留在稳定隔室中，而是连续以逆行方式运输到“成熟”较年轻的囊腔及其货物中。
囊腔成熟在高尔基体酶定位中的作用得到了以下观察结果的支持：参与逆行囊泡运输的保守寡聚高尔基体 (COG) 复合体蛋白中的突变会影响高尔基体酶的分布和整体蛋白质糖基化。COG 复合体是一个八个亚基的异源寡聚体，被认为是一种细胞质栓系复合体，可在囊泡融合之前将传入囊泡连接到其靶隔室。该复合体被认为与 COPI 亚基在与高尔基体内和高尔基体到 ER 运输相关的逆行囊泡运输中协同作用。COG 亚基中的突变会导致堆叠中几种高尔基体糖基转移酶的不稳定和/或错误定位，以及相应的糖基化缺陷。COG 复合体不直接与高尔基体酶相互作用，但它对高尔基体系统中的逆行囊泡运输至关重要，并以此方式影响整体高尔基体结构，从而确保高效糖基化。值得注意的是，几种先天性糖基化障碍 II 型 (CDG−II) 是 COG 亚基突变的结果。
使用突变体和嵌合高尔基体酶的研究表明，不同的酶对其定位有不同的要求。早期工作指出酶的 TM 区域，例如 GlcNAcT-1（中间高尔基体）、GalT-1（反式高尔基体）和 ST6Gal-I（反式高尔基体和 TGN），但后来的研究表明，对于许多酶来说，是多个信号和机制在起作用。同源和异源寡聚化在某些高尔基体酶定位中的作用已得到证实。此外，大量证据支持糖基转移酶细胞质尾部在酶逆行运输和高尔基体定位中的作用。
膜蛋白 TM 区域的长度和疏水性决定了其分配到膜微区的能力，现在被认为参与了整个细胞的膜蛋白运输和定位。胆固醇的浓度和膜的宽度在整个分泌途径中增加，最宽、最富含胆固醇的膜发现于细胞表面。使用含胆固醇模型膜的实验表明，较短的 TM 肽分配到较薄的膜中，而较长的 TM 肽分配到较厚的膜中。胆固醇“拉直”脂质酰基链的趋势可能使得 TM 肽分配到不匹配厚度的膜中在能量上更加困难。
为了支持膜厚度可能有助于分泌途径中膜蛋白定位的观点，有人指出 ER 蛋白的 TM 区域比质膜蛋白短，而高尔基体酶的 TM 区域介于 ER 和质膜蛋白之间。然而，在高尔基体酶中，随着从细胞器的顺式面移动到反式面，TM 长度并没有严格增加。一种可能性是，TM 区域长度对囊腔定位的相对影响取决于特定酶定位所涉及的其他序列和机制。尽管如此，至少，高尔基体酶较短的 TM 区域可能会通过降低它们分配到注定用于后高尔基体隔室（如质膜）的载体的更厚、富含胆固醇的膜的能力，从而阻止这些蛋白质离开高尔基体系统。
有助于高尔基体酶定位的另一种机制是它们形成寡聚体复合物的能力。N-连接和 O-连接糖基化途径中的几乎所有酶都形成同源二聚体，许多酶也形成异源复合物。在某些情况下，异源复合物的形成是 pH 依赖性的。在同一途径中催化连续反应并定位于同一囊腔的酶之间观察到异源复合物的形成。例如，在 N-糖基化途径中，在中间高尔基体中两种 N-乙酰葡糖胺基转移酶 (GlcNAcT−I 和 GlcNAcT−II) 之间以及在反式高尔基体中 GalT−I 和 ST6Gal−I 之间形成了复合物。值得注意的是，不在同一途径中的酶（例如 O-糖基化和 N-糖基化酶）和在同一途径中，但催化竞争性或非连续事件的酶不形成异源复合物，即使它们定位于同一囊腔。途径中连续酶之间的复合物可以通过促进底物通道化来提高糖基化效率，其中一个酶将新修饰的底物交给途径中的下一个酶。
综上所述，证据表明糖基化酶使用多种机制来维持其高尔基体定位。一个酶使用的信号和机制的数量可能决定了其高尔基体定位的稳定性、它是否能够移动到后来的隔室，以及它是否被切割并分泌到细胞外空间。
【进阶】
- 糖基化前体 #95
