【预备知识】
- 糖生物学 #80
- 糖基化在生物体中普遍存在 #92
在自然界中，大多数聚糖 (glycans) 是由糖基转移酶 (glycosyltransferases) 合成的。这些酶将活化形式的单糖从核苷酸糖 (nucleotide sugars) 和脂质连接的糖中间体 (lipid-linked sugar intermediates) 转移到受体上，受体包括蛋白质、脂质和不断增长的聚糖链。
单糖前体被导入细胞，从降解的聚糖中回收 (salvaged)，或在细胞内通过酶促反应由其他糖类生成。在真核细胞中，糖基化主要发生在内质网 (ER) 和高尔基体 (Golgi apparatus) 中，而单糖的活化和相互转化则主要发生在细胞质 (cytoplasm) 中。核苷酸糖特异性转运蛋白将活化的糖供体运入高尔基体，并较少地运入内质网。在某些情况下，核苷酸糖在聚糖转移之前用于合成活化的脂质连接中间体。
一般原理
葡萄糖 (Glucose) 和果糖 (fructose) 是酵母和人类等各种生物体的主要碳源和能源。大多数生物体可以从这些来源合成聚糖生物合成所需的其他单糖 (monosaccharides)。并非所有这些生物合成途径在所有类型的细胞中都同样活跃。然而，有一些一般原理：
单糖必须被活化为高能供体才能用于聚糖合成。
这个过程需要核苷三磷酸（通常是 UTP 或 GTP）和糖基-1-磷酸 (glycosyl-1-P)（在异头碳上带有磷酸盐的单糖）。
它们可以通过激酶活化（反应 1），或由先前合成的活化核苷酸糖生成（反应 2 和 3）：
唾液酸 (Sialic acids) 及其进化祖先（原核壬酮糖酸 (nonulosonic acids) 和 Kdo）是动物中唯一以 CMP-单核苷酸形式活化的单糖。艾杜糖醛酸 (Iduronic acid) 没有核苷酸糖亲本，因为它是在葡糖醛酸 (glucuronic acid) 掺入糖胺聚糖 (GAG) 链后通过差向异构 (epimerization) 形成的。在某些情况下，一种核苷酸糖可以通过直接差向异构（上文的反应 2）或核苷酸交换反应（上文的反应 3）从另一种核苷酸糖形成。例如，UDP-半乳糖 (UDP−Gal) 是通过 Gal-1-P 替换 Glc-1-P 从 UDP-Glc 制成的。
表 动物细胞中最常见的活化糖供体
| 糖 | 活化形式 |
|---|
| Glc (葡萄糖) | UDP-糖 |
| Gal (半乳糖) | UDP-糖 |
| GlcNAc (N-乙酰葡糖胺) | UDP-糖 |
| GalNAc (N-乙酰半乳糖胺) | UDP-糖 |
| GlcA (葡糖醛酸) | UDP-糖 |
| Xyl (木糖) | UDP-糖 |
| Man (甘露糖) | GDP-糖 |
| Fuc (岩藻糖) | GDP-糖 |
| Sia (唾液酸) | CMP-Sia |
外部糖源和糖转运蛋白
有三种类型的糖转运蛋白将糖分子跨越细胞膜运入细胞：
非能量依赖性易化扩散转运蛋白 (energy-independent facilitated diffusion transporters)，例如在酵母和大多数哺乳动物细胞中发现的葡萄糖转运蛋白 (GLUT) 家族的己糖转运蛋白 (hexose transporters)。编码这些蛋白质的基因被命名为 SLC2A (solute carriers 2A)。
能量依赖性转运蛋白 (energy-dependent transporters)——例如，在肠和肾上皮细胞中的钠依赖性葡萄糖转运蛋白 (SGLT)（基因名称 SLC5A）。
将 ATP 依赖性磷酸化与糖输入偶联 (couple ATP-dependent phosphorylation with sugar import) 的转运蛋白。这些存在于细菌中。
GLUT 家族转运蛋白最早在酵母中被描述，已知至少有 18 个基因。人类有 14 种 GLUT 同源物。GLUT 转运蛋白的大小约为 40至70 kDa，结构相似，包含 12 个跨膜域 (membrane-spanning domains)，这是许多真核转运蛋白的典型特征。跨膜域形成一个带有小孔的桶状结构供糖通过。与其他家族成员相比，GLUT1 具有适度的（28%至65%）氨基酸同一性。存在由相对于跨膜域特定位置的一个或几个氨基酸组成的“糖转运蛋白特征”，但没有主要的转运蛋白基序。
通常，GLUTs 对葡萄糖摄取的 Km 值在 1至20 mM 范围内。在酵母中，许多转运葡萄糖，但有些对半乳糖、果糖或二糖具有特异性。大多数哺乳动物 GLUT 蛋白以不同的效率转运葡萄糖或果糖，但在生理环境中没有完全明确的特异性。然而，GLUT5 主要转运果糖 (fructose)，而被称为 HMIT 的 GLUT 是一种质子偶联的肌醇转运蛋白 (proton-coupled myo-inositol transporter)。GLUT2 也有效地转运葡糖胺 (glucosamine)。
葡萄糖通过需要能量的 SGLT-1 从肠腔转运，并通过相关的转运蛋白 SGLT-2 从肾小球滤液中回收。SGLT 型转运蛋白对葡萄糖的 Km 值 <1 mM。
GLUT1–5 在不同的哺乳动物细胞中具有不同的分布，并具有不同的 Km 值，使它们能够响应葡萄糖的可用性。虽然大多数人类 GLUT 成员位于细胞表面，但一部分 GLUT4 驻留在细胞内囊泡中，这些囊泡响应胰岛素被招募到细胞表面。在高碳水化合物餐后，肠道中 SGLT-1 转运的葡萄糖被认为会促进 GLUT2 招募到顶端表面 (apical surface)，从而增强葡萄糖的摄取。
单糖的细胞内来源
回收 (Salvage)
单糖可以从细胞内降解的聚糖中回收。大多数降解发生在溶酶体 (lysosomes) 中的低 pH 环境中。回收途径受到的关注相对较少，但它们对糖基化的贡献可能相当可观。例如，肝脏溶酶体中降解的糖蛋白中 80% 的放射性标记 N-乙酰葡糖胺 (N-acetylglucosamine) 被转化为 UDP-GlcNAc，其中至少三分之一用于合成分泌性糖蛋白。此外，成纤维细胞内吞标记的聚糖，并将其约 50% 的氨基糖 (amino sugars) 重复用于糖蛋白的新合成 (de novo glycoprotein synthesis)。高效的回收不限于 GlcNAc。源自内吞的细胞外聚糖的大部分唾液酸可以被重复利用。
降解释放的单糖必须离开溶酶体。存在针对中性己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）、N-乙酰化氨基糖和酸性糖的不同溶酶体载体；中性糖载体对己糖底物的 Km 值为 50至75 mM，但它也转运岩藻糖 (fucose) 和木糖 (xylose)。N-乙酰己糖胺载体 (Km∼4 mM) 不能转运非乙酰化氨基糖。唾液酸和葡糖醛酸载体 (Km∼300至550 µM) 很重要，因为它的缺失会导致这些糖在溶酶体中积累并分泌到尿液中，基因突变会导致人类溶酶体贮积病。大多数到达细胞质的单糖会被活化和重复利用，如下所述。然而，糖醛酸 (uronic acids) 在动物体内不能被重复利用，并通过磷酸戊糖途径 (pentose phosphate pathway) 降解。从 N-聚糖加工或周转中释放的甘露糖 (Mannose) 通过己糖转运蛋白/交换器运出细胞，很少或没有直接再利用。
聚糖回收途径在临床上被用于减轻某些罕见先天性糖基化障碍（针对糖生物合成或转运）的影响。在实验中，回收途径被用于操纵核苷酸糖库 (manipulate nucleotide sugar pools)、掺入具有生物正交化学手柄的聚糖 (incorporate glycans with biorthogonal chemical handles)以及生成代谢性糖基转移酶抑制剂。
单糖的活化和相互转化
糖原 (Glycogen)
糖原 (Glycogen) 是一个巨大的分子，含有多达 10 万个葡萄糖单位，排列成 Glcα1–4Glc 重复二糖，并周期性地带有 α1–6Glc 分支。它在一种细胞质蛋白质糖原素 (glycogenin) 上合成。糖原是动物细胞中主要的储存多糖 (storage polysaccharide)，其合成和降解（糖原分解，glycogenolysis）受到高度调节以供能源使用。糖原是通过从 UDP-Glc 中添加单个葡萄糖单位来合成的，并由糖原磷酸化酶 (glycogen phosphorylase) 降解。这种不依赖 ATP 的反应通过糖原的磷酸化 (phosphorolysis) 形成葡萄糖-1-磷酸 (glucose-1-P)。该底物可直接用于形成 UDP-Glc 或转化为葡萄糖-6-磷酸 (glucose-6-P)，以便通过糖酵解 (glycolysis) 进一步分解代谢或通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶直接氧化。
葡萄糖 (Glucose)
葡萄糖是碳水化合物代谢的核心单糖，它可以直接或间接转化为所有其他糖。葡萄糖首先被己糖激酶 (hexokinase) 转化为 葡萄糖-6-磷酸 (glucose-6-P)。在糖酵解途径中，葡萄糖-6-磷酸通过磷酸葡糖异构酶 (phosphoglucose isomerase) 转化为果糖-6-磷酸 (fructose-6-P)，或通过磷酸葡糖变位酶 (phosphoglucomutase) 转化为葡萄糖-1-磷酸 (glucose-1-P)。葡萄糖-1-磷酸与 UTP 在UDP-葡萄糖焦磷酸化酶 (UDP-glucose pyrophosphorylase) 的作用下反应，形成高能供体 UDP-Glc。UDP-Glc 库用于合成糖原 (glycogen) 和其他含葡萄糖分子，例如葡萄糖基神经酰胺 (glucosylceramide)和萜醇-P-葡萄糖 (dolichol-P-glucose)，后者用于 N-连接聚糖生物合成途径。
图 Essentials of Glycobiology, 4E. Fig. 5.1 展示了单糖的生物合成和相互转化过程，其中矩形代表供体 (donors)，椭圆形代表单糖 (monosaccharides)，而星号则标示出控制点 (control points)；图中列出的 Kdn 是 2-酮-3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬酮酸的缩写，Dol 则代表萜醇 (dolichol)；尽管该图描绘了多种途径，但在生理条件下每条途径的相对贡献目前仍是未知的；有关单糖的完整名称和指定符号。
葡萄糖-6-磷酸也是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的底物，这是其通过磷酸戊糖途径 (pentose phosphate pathway) 氧化的入口点 (entry point)，随后产生 6-磷酸葡萄糖酸 (6-phosphogluconate)，然后是核糖-5-磷酸 (ribose-5-phosphate)。这些反应生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)，这是维持适当氧化还原状态 (redox status) 所必需的。
葡糖醛酸 (Glucuronic Acid)
UDP-GlcA（葡糖醛酸）是直接从 UDP-Glc 合成的，需要两个 NAD+-依赖性 C-6 氧化的两阶段反应。UDP-GlcA 主要用于 GAG 生物合成，但一些 N-和 O-连接聚糖和鞘糖脂 (glycosphingolipids) 也含有葡糖醛酸。在肝细胞中，将葡糖醛酸添加到胆汁酸 (bile acids) 和外源性化合物 (xenobiotic compounds)（例如药物和毒素）中会增加它们的溶解度，并且一大类微粒体葡糖醛酸转移酶 (microsomal glucuronosyltransferases) 致力于这些反应。
艾杜糖醛酸 (Iduronic Acid)
艾杜糖醛酸是 GlcA 的 C-5 差向异构体 (C-5 epimer)，存在于 GAG 硫酸皮肤素 (dermatan sulfate)、硫酸乙酰肝素 (heparan sulfate) 和肝素 (heparin) 中。艾杜糖醛酸不是直接从核苷酸糖供体合成的。相反，它是在 GlcA 掺入不断增长的 GAG 链后通过差向异构生成的。
木糖 (Xylose)
UDP-GlcA 的脱羧 (Decarboxylation) 生成 UDP-Xyl，在脊椎动物中用于启动 GAG 合成。
木糖还存在于具有表皮生长因子 (EGF) 模块中 O-葡萄糖修饰的蛋白质上和 α-肌营养不良蛋白聚糖 (dystroglycan) 上的 O-甘露糖基聚糖上，以及植物 N-聚糖上。一种 II 型膜蛋白使用转运到 ER 或高尔基体中的 UDP-GlcA 执行脱羧反应。
在秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans) 中，脱羧酶被称为 SQV-1，它与 UDP-GlcA 转运蛋白共定位。
在拟南芥 (Arabidopsis) 中，另一种 UDP-GlcA 脱羧酶也存在于细胞质中，但在动物中尚未鉴定出其直系同源物。
图 Essentials of Glycobiology, 4E. Fig. 5.2 展示了UDP-木糖 (UDP−xylose) 和支链糖供体 UDP-芹糖 (UDP−apiose) 均由 UDP-GlcA 生物合成的途径；木糖 (xylose) 存在于动物和植物中，而芹糖 (apiose) 仅用于植物多糖，例如浮萍 (Lemna minor) 中的芹糖半乳糖醛酸聚糖 (apiogalacturonan)；值得注意的是，木糖和芹糖的合成过程具有相似性和重叠；它们之间唯一的区别在于：合成芹糖时，C-3 通过未知机制被移除，并且新形成的醛被还原，从而产生了支链糖供体。
甘露糖 (Mannose)
甘露糖用于多种类型的聚糖。
鸟苷二磷酸甘露糖 (GDP-Man) 是主要的活化供体。它的产生需要先合成甘露糖-6-磷酸 (mannose-6-P) 并将其转化为甘露糖-1-磷酸 (mannose-1-P)。产生甘露糖-6-磷酸的两种方法是通过己糖激酶直接磷酸化，或使用磷酸甘露糖异构酶 (phosphomannose isomerase) 将果糖-6-磷酸 (fructose-6-P) 转化为甘露糖-6-磷酸。在酵母中，这种酶的缺失是致命的。在人类中，这种酶的缺失会导致一种可能致命的疾病，称为先天性糖基化障碍 (CDG) Ib 型或 MPI-CDG。
磷酸甘露糖异构酶很重要，因为游离的外源性甘露糖在饮食中不常见，而这种酶是甘露糖与葡萄糖之间的关键环节。外源性甘露糖可以挽救酵母和人类的磷酸甘露糖异构酶缺陷（尽管过量的甘露糖是有毒的）。缺乏磷酸甘露糖异构酶活性的小鼠会胎死腹中 (die in utero)，因为 Man-6-P 的积累会抑制糖酵解并耗尽 ATP。在哺乳动物中，甘露糖-6-磷酸通过磷酸甘露糖变位酶 (phosphomannomutase) 转化为甘露糖-1-磷酸。由于甘露糖-6-磷酸和甘露糖-1-磷酸都是 GDP-Man 的必需前体 (obligate precursors)，未能合成足量的其中任何一个都会减少 GDP-Man 的形成，后者是脂质连接寡糖的直接供体和萜醇-P-甘露糖 (dolichol-P-mannose) 的前体，后者服务于多种糖基化途径。
甘露糖-6-磷酸还可以与磷酸烯醇式丙酮酸 (phosphoenolpyruvate) 缩合 (condense) 形成 2-酮-3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬酮酸 (Kdn)。这种分子与 CTP 活化以产生 CMP-Kdn，在鱼类中含量丰富（例如，在鳟鱼睾丸和它们的精子上），被认为对精卵粘附很重要。
岩藻糖 (Fucose)
鸟苷二磷酸岩藻糖 (GDP-Fuc) 可以通过两种酶的连续作用，涉及三个步骤，从 GDP-Man 衍生而来。
在第一步中，GDP-Man 4,6-脱水酶 (GDP-Man 4,6-dehydratase) 将 GDP-Man 的 C-4 羟基氧化成酮（GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖），同时将 NADP+ 还原为 NADPH。
接下来的两个反应由一个单一的多肽（人类中的 GDP-L-Fuc 合酶）催化，该多肽具有差向异构酶 (epimerase) 和还原酶 (reductase) 活性，从细菌到哺乳动物都高度保守。GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖在 C-3 和 C-5 处发生差向异构形成 GDP-4-酮-6-脱氧葡萄糖，然后用 NADPH 在 C-4 处还原形成 GDP-Fuc。
第一个氧化步骤受到 GDP-Fuc 的反馈抑制 (feedback-inhibited)。
GDP-Fuc 也可以直接从岩藻糖合成。第一步是使用激酶制造岩藻糖-1-磷酸 (fucose-1-P)，然后将其转化为 GDP-Fuc。突变型 CHO 细胞无法将 GDP-Man 转化为 GDP-Fuc，会形成岩藻糖基化不足 (hypofucosylated) 的蛋白质，但这可以通过在培养基中提供外源性岩藻糖来纠正。此外，基因缺陷了 GDP-Man 到 GDP-Fuc 转化的小鼠可以通过在食物或饮用水中提供岩藻糖来挽救。除了葡萄糖以外的糖的细胞膜转运蛋白已被表征，岩藻糖转运蛋白也可能存在，尽管它们尚未得到充分表征，因此它们的定量贡献尚不清楚。与除葡萄糖以外的许多单糖一样，血液中游离岩藻糖的浓度处于非常低的微摩尔范围。
图 Essentials of Glycobiology, 4E. Fig. 5.3 展示了活化糖供体的转化过程：(A) 描绘了 GDP-Man 合成 GDP-Fuc 的步骤，(B) 描绘了 UDP-Glc 转化为 UDP-Gal 的步骤。需要注意的是，通过图示途径合成 GDP-Fuc 是不可逆的，而 UDP-Glc 和 UDP-Gal 的相互转化则是容易可逆的。
半乳糖 (Galactose)
UDP-Gal 可以通过两步反应制成：第一步是半乳糖 (galactose) 在 C-1 处通过 ATP 依赖性磷酸化（由半乳糖激酶 galactokinase）形成半乳糖-1-磷酸 (galactose-1-P)；第二步是半乳糖-1-磷酸在半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶 (galactose-1-phosphate uridylyltransferase) 的作用下，取代 UDP-Glc 中的葡萄糖-1-磷酸 (glucose-1-P) 形成 UDP-Gal。这种酶活性的缺乏会导致一种严重的人类疾病，称为半乳糖血症 (galactosemia)，如果不控制半乳糖摄入，会导致智力障碍 (intellectual disability)、肝损伤 (liver damage)，并最终死亡。最后，UDP-Gal 可以通过 UDP-Gal 4-差向异构酶 (UDP-Gal 4-epimerase) 催化的 NAD-依赖性反应从 UDP-Glc 形成。该酶首先将 C-4 羟基转化为酮衍生物，从结合的 NAD+ 形成 NADH。在下一步中，酮基被转化回具有相反方向的羟基，并重新形成 NAD^+。在哺乳动物中，相同的酶会相互转化 UDP-GalNAc 和 UDP-GlcNAc。
半乳糖通常以吡喃糖 (p) 环的形式存在于“高等”动物中，但细菌和致病真核生物，如利什曼原虫 (Leishmania) 和曲霉 (Aspergillus)，将呋喃半乳糖 (f) 掺入其聚糖中。供体是通过使用黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性变位酶将 UDP-Gal(p) 转化为 UDP-Gal(f) 形成的。
N-乙酰葡糖胺 (N-Acetylglucosamine)
尿苷二磷酸 N-乙酰葡糖胺 (UDP-GlcNAc) 的酶促合成始于谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶 (GFAT) 使用谷氨酰胺作为 −NH2 供体，通过转氨作用 (transamination) 从果糖-6-磷酸 (fructose-6-P) 形成葡糖胺-6-磷酸 (glucosamine-6-P)。然后，葡糖胺-6-磷酸通过 乙酰-CoA 介导的反应进行 N-乙酰化，形成 N-乙酰葡糖胺-6-磷酸 (N-acetylglucosamine-6-P)，然后通过 1,6-二磷酸中间体异构化为 N-乙酰葡糖胺-1-磷酸 (N-acetylglucosamine-1-P)。与其他活化反应类似，N-乙酰葡糖胺-1-磷酸然后与 UTP 反应形成 UDP-GlcNAc 和焦磷酸盐 (pyrophosphate)。或者，GlcNAc 可以通过一种激酶直接磷酸化形成 N-乙酰葡糖胺-6-磷酸，该激酶也从 N-乙酰甘露糖胺 (N-acetylmannosamine) 合成 N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸。然后，磷酸-N-乙酰葡糖胺变位酶 (Phospho-N-acetylglucosamine mutase) 将 N-乙酰葡糖胺-6-磷酸转化为 N-乙酰葡糖胺-1-磷酸。该途径可能解释了 GlcNAc 从聚糖的溶酶体降解中有效回收的原因。葡糖胺也可以在连续的磷酸化和乙酰化后被回收。
N-乙酰半乳糖胺 (N-Acetylgalactosamine)
在动物中，UDP-GalNAc 可以源于两条途径。一条是 N-乙酰半乳糖胺-1-磷酸 (N-acetylgalactosamine-1-P) 与 UTP 的直接反应。N-乙酰半乳糖胺-1-磷酸由一种特定激酶形成，该激酶与半乳糖-1-激酶不同。UDP-GalNAc 也可以通过差向异构化 UDP-GlcNAc 形成，使用与将 UDP-Glc 转化为 UDP-Gal 相同的 NAD-依赖性差向异构酶。
唾液酸 (Sialic Acids)
唾液酸 (Sialic acids) 包括三种母体化合物：N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸 (Neu5Gc) 和 Kdn。所有这些化合物都会转化为 CMP 核苷酸糖。
胞苷-5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸 (CMP-Neu5Ac) 的生成比其他活化糖的形成更为复杂。
首先，UDP-GlcNAc 通过具有两种催化活性的双功能酶——UDP-N-乙酰葡糖胺 2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶 (GNE)——转化为 N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸 (N-acetylmannosamine-6-P)。
- 第一种活性将 UDP-GlcNAc 的 GlcNAc 在 C-2 位差向异构 (epimerizes) 并裂解 UDP，产生 N-乙酰甘露糖胺 (ManNAc)。
- 在下一个反应中，激酶活性利用 ATP 形成 ManNAc-6-P。
- 该酶的突变会导致两种完全不同的代谢紊乱：唾液酸尿症 (sialuria) 和包涵体肌病 2 型 (inclusion body myopathy type 2)。在小鼠中敲除该基因会导致早期胚胎致死 (early embryonic lethality)。
在下一步中，ManNAc-6-P 与磷酸烯醇式丙酮酸 (phosphoenolpyruvate) 缩合 (condensed) 形成 N-乙酰神经氨酸-9-磷酸 (N-acetylneuraminic acid-9-P)。
随后，磷酸酶 (phosphatase) 会去除磷酸盐 (phosphate)。
与 CTP 活化会产生 CMP-Neu5Ac，这是某些生物体中羟化酶 (hydroxylase) 的靶点，后者将其中的一部分转化为 CMP-Neu5Gc。
出于未知原因，最后这些步骤在脊椎动物细胞的细胞核 (nucleus) 中发生，随后活化的前体被运出 (export) 到细胞质 (cytoplasm)。唾液酸转移到寡糖受体 (oligosaccharide acceptor) 后，唾液酸的其他修饰可以在高尔基体 (Golgi) 中发生。
唾液酸可以从内部糖蛋白周转 (internal glycoprotein turnover) 或血浆 (plasma) 中回收，并通过磷酸化和添加来自 CTP 的 CMP 进行活化。此外，GlcNAc 可以被活化为 UDP-GlcNAc 并重新进入 CMP-Neu5Ac 的生物合成途径。
