【预备知识】
- 真核生物分泌途径中的糖基化 #93
- 糖基化前体 #95
核苷酸糖转运蛋白 (Nucleotide Sugar Transporters)
在真核生物中，核苷酸糖 (nucleotide sugars) 在细胞质 (cytoplasm) 或细胞核 (nucleus) 中合成，而大多数糖基化 (glycosylation) 发生在内质网 (ER) 或高尔基体 (Golgi) 腔内（例外是透明质酸 hyaluronan 和核胞质糖基化 nucleocytoplasmic glycosylation）。因此，新合成的核苷酸糖对于大多数糖基化反应来说处于膜的“错误”一侧 (“wrong” side of the membrane)，因此必须被转运到 ER 和高尔基体中。
负电荷 (Negative charge) 阻止这些供体简单地扩散 (diffusing) 到这些区室中。为了克服这个障碍，真核细胞有一套不依赖能量的核苷酸糖逆向转运蛋白 (energy-independent nucleotide sugar antiporters)，它们将核苷酸糖输送到这些细胞器的腔 (lumen) 内，同时核苷一磷酸 (nucleoside monophosphates) 离开 (exiting)，其中大部分必须首先由核苷二磷酸酶 (nucleoside diphosphatase) 从核苷二磷酸 (nucleoside diphosphates) 生成。这种转运机制已通过生化方法在分离的囊泡 (isolated vesicles) 中确定，并通过遗传方法在各种突变细胞系 (mutant cell lines) 中确定。这些转运蛋白的 Km 范围为 1至10 µM。使用体外系统 (in vitro systems) 已证明这些转运蛋白将核苷酸糖在高尔基体腔内的浓度提高了 10 到 50 倍。这通常足以达到或超过使用这些供体的糖基转移酶 (glycosyltransferases) 的计算 Km。
图 Essentials of Glycobiology, 4E. Fig. 5.4. 位于哺乳动物、酵母、原生动物和植物高尔基体膜中的一些已知的核苷酸糖、PAPS (3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐) 和 ATP 的转运蛋白。这些蛋白质充当逆向转运蛋白 (antiporters)，在将核苷酸糖输送到内质网 (ER) 或高尔基体区室的同时，将相应的核苷一磷酸 (nucleoside monophosphate) 送回细胞质 (cytoplasm)；由于大多数糖基化反应会产生核苷二磷酸 (nucleoside diphosphate)，因此需要将其转化为核苷一磷酸才能被转运；对于 PAPS 而言，相应的运出分子 (exiting molecule) 尚不清楚，而对于 ATP 来说，运出分子是 AMP、ADP 或两者皆有；图中所示的磷酸盐 (Pi) 转运蛋白是假想的 (hypothetical)。
大多数这些逆向转运蛋白位于高尔基体中，但有些也位于 ER 中。它们是细胞器特异性 (organelle-specific) 的，并且它们的位置通常与相关糖基转移酶的位置相对应。核苷酸糖导入高尔基体不依赖能量，也不受离子载体 (ionophores) 的影响。然而，这种导入受到细胞溶胶 (cytosol) 中相应核苷一磷酸和二磷酸的竞争性抑制 (competitively inhibited)，但不受单糖的抑制。还存在ATP 和 PAPS (3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐) 的转运蛋白，它们用于碳水化合物和蛋白质的硫酸化 (sulfation)。
表 高尔基体和 ER 中的核苷酸转运
| 核苷酸 | ER | Golgi |
|---|
| CMP-Sia | − | +++ |
| GDP-Fuc | ++ | +++ |
| UDP-Gal | − | ++++ |
| PAPS | − | ++++ |
| GDP-Man | − | ++++ |
| UDP-GlcNAc | +++ | +++ |
| UDP-GalNAc | ++ | +++ |
| UDP-Xyl | ++ | +++ |
| ATP | ++++ | +++ |
| UDP-GlcA | ++++ | ++++ |
| UDP-Glc | ++ | +++ |
注：核苷酸转运蛋白在 ER 和高尔基体中的相对分布由加号 (+) 的数量表示。减号 (-) 表示该转运蛋白未在该区室中发现。
胆汁 (bile) 和外源性化合物 (xenobiotic compounds) 在 ER 中的葡糖醛酸化 (glucuronidation) 解释了肝细胞 ER 中对 UDP-GlcA 转运蛋白的需求。高尔基体转运蛋白的存在与使用 UDP-GlcA 形成 GAG 链和其他类别聚糖的糖基转移酶的位置一致。错误折叠糖蛋白 (misfolded glycoproteins) 的再糖基化 (reglycosylation) 发生在 ER 中的观察解释了对 ER UDP-Glc 转运蛋白的需求。在压力条件下，腔内尿苷二磷酸酶 (lumenal uridine diphosphatase) 的合成增加，以适应错误折叠糖蛋白再糖基化所需的 UDP-Glc 增加的转运。UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc 和 UDP-Xyl 转运蛋白在 ER 中的存在可能意味着一些被认为仅发生在高尔基体中的反应也可能发生在 ER 中。一个很好的例子是 ER 中 O-岩藻糖基化蛋白质（如 Notch）的合成与高尔基体中 N-和 O-连接链的岩藻糖基化之间的对比。其他尚未发现的糖基化反应也可能发生在 ER 中。
UDP-Gal、CMP-Sia、GDP-Fuc、UDP-GlcA/UDP-GalNAc 和 UDP-GlcNAc 等几种核苷酸糖转运蛋白的突变会导致人类糖基化障碍，产生不完整的糖链 (incomplete sugar chains)。突变型哺乳动物细胞系也缺乏特定的核苷酸糖转运蛋白（例如 UDP-Gal 或 CMP-Sia 的转运蛋白）。然而，此类突变体中存在一定的**“渗漏”** (“leakiness”)。例如，MDCK（Madin–Darby 犬肾）突变细胞高尔基体中 UDP-Gal 转运蛋白的缺失会减少硫酸角质素 (keratan sulfate) 和半乳糖基化糖蛋白 (galactosylated glycoproteins) 和糖脂 (glycolipids) 的合成，但对硫酸乙酰肝素 (heparan) 和硫酸软骨素 (chondroitin sulfate) 没有影响。这可能是因为合成 GAG 链常见的核心区四糖 (core region tetrasaccharide) 的半乳糖基转移酶 (galactosyltransferases) 对其供体的 Km 值较低。
通过同源性 (homology) 在哺乳动物、黑腹果蝇 (Drosophila melanogaster)、秀丽隐杆线虫 (C. elegans)、植物和酵母的基因组中鉴定出许多推定的转运蛋白 (putative transporters)。与上面讨论的细胞膜 GLUT 转运蛋白一样，它们都是多跨膜（III 型）蛋白，但氨基酸同一性的水平并不能提供任何关于底物特异性的线索。来自哺乳动物细胞和酵母的 UDP-GlcNAc 转运蛋白有 22% 的同一性，而哺乳动物的 CMP-Sia、UDP-Gal 和 UDP-GlcNAc 转运蛋白有 40%至50% 的同一性。巧妙的结构域交换实验 (domain-swapping experiments) 表明，不同的区域负责功能性转运，并且工程化的嵌合转运蛋白 (engineered chimeric transporters) 可以同时转运 CMP-Sia 和 UDP-Gal。对真核生物 GDP-甘露糖和 CMP-唾液酸转运蛋白的生物物理研究阐明了核苷酸糖选择性和转运蛋白功能中膜脂质相互作用的结构基础。
异源表达 (Heterologous expression) 或转运蛋白缺陷细胞系的拯救 (rescue) 可用于分析推定转运蛋白的功能。例如，在酵母中表达秀丽隐杆线虫基因 SQV-7 表明，这一个蛋白质可以转运 UDP-GlcA、UDP-GalNAc 和 UDP-Gal，而突变等位基因 (mutant alleles) 不能转运这些供体中的任何一个。人类基因 SLC35B4 编码一种双功能转运蛋白 (bifunctional transporter)，可识别 UDP-Xyl 和 UDP-GlcNAc。另一个例子是利什曼原虫 (Leishmania) 的 GDP-Man 转运蛋白，它也可以转运 GDP-Fuc 和 GDP-阿拉伯糖 (GDP-arabinose)。这一点说明功能性、生化分析是必不可少的；遗传同源性不足以推断特异性。此外，并非所有潜在的类似转运蛋白的基因都已被分配特定的生理底物 (physiological substrates)。
理论上，糖基化可以部分通过调节高尔基体内核苷酸糖的可用性来控制，这可能是通过调节转运蛋白来实现的。转运蛋白在高尔基体中的亚区室位置（顺式 cis、中间 medial、反式 trans）尚不清楚，转运蛋白与其所服务的各种糖基转移酶之间的物理关系也不清楚。显然，一个功能性的高尔基体区室需要核苷酸糖供体和受体以及共定位的转移酶。关于糖基化反应在高尔基体中实际如何发生的研究很少。它更像溶液化学 (solution chemistry) 还是更像固态转移 (solid-state transfers)？真的存在核苷酸糖的“可溶性库” (“soluble pools”) 吗？用绿色荧光蛋白 (GFP) 标记的糖基转移酶的戏剧性延时视频 (dramatic time-lapse videos) 显示，这些蛋白质在高尔基体内高度移动 (highly mobile)，但也有物理证据表明存在多糖基转移酶复合物 (multiglycosyltransferase complexes) 参与 N-连接聚糖、鞘糖脂和硫酸乙酰肝素的生物合成。许多转运蛋白似乎以同型二聚体 (homodimers) 的形式发挥作用，酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 中的 GDP-Man 转运蛋白 (VRG4) 在 ER 中寡聚化 (oligomerizes)，并似乎通过主动过程转运到高尔基体。此外，半乳糖神经酰胺 (galactosylceramide) 的合成发生在 ER 中，并且一部分 UDP-Gal 转运蛋白特异性地结合到半乳糖神经酰胺合酶 (galactosylceramide synthase) 并保留在 ER 中以提供供体底物。
在线粒体 (mitochondria) 中发现蛋白质 O-GlcNAcylation及其循环 O-GlcNAc 的酶表明存在核苷酸糖转运蛋白，它们将线粒体内外膜 (outer and inner mitochondrial membranes) 连接到细胞溶胶 (cytosol)。最近的数据表明，嘧啶核苷酸载体 (pyrimidine nucleotide carrier) 是 UDP-GlcNAc 的有效转运蛋白。
