酵母的糖工程

一号

【预备知识】

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酵母天然在各种糖蛋白上产生 N-聚糖和 O-甘露糖基聚糖。初始聚糖转移的生物合成途径的一般特征在从酵母到人类的真核生物中是共同的，所涉及的酶是高度同源的。然而，酵母中随后的聚糖加工通常会导致聚甘露糖基化聚糖，而不是在“高等”真核生物中发现的复杂N-和O-聚糖。

与细菌不同，酵母具有与其他真核细胞相似的蛋白质折叠、质量控制和翻译后修饰系统。由于酵母中的基因工程长期以来是快速且容易的，因此与其他大多数生物体相比，该生物体的糖工程经验更为先进。一些商业活动基于在酵母中工程化**“人源化”N-糖基化**；毕赤酵母 GlycoSwitch平台使用工程化酵母向表达的蛋白质添加简单的人类N-聚糖。

N-糖基化工程

酵母糖蛋白上的 N-聚糖与脊椎动物中的不同，包含在 poly(Manα1-6)n 主链上的大型聚甘露糖基化聚糖，它们在哺乳动物中高度免疫原性。一个关键的 α1-6-甘露糖基转移酶，Och1p，主要启动聚甘露糖基化。然而，och1 基因的敲除并不能完全消除聚甘露糖基化，根据酵母菌株的不同，需要额外敲除甘露糖基转移酶和磷酸甘露糖基转移酶才能获得适合进一步工程化的均一 Man8GlcNAc2 N-聚糖。通过在内质网（ER）中表达 α1-2-甘露糖苷酶，将 Man8GlcNAc2 减少到 Man5GlcNAc2，从而为生成复杂N-聚糖创建了一个方便的平台。在高尔基体中引入 GlcNAcT-I (MGAT1) 启动复杂N-聚糖合成，进一步添加 α3/6-甘露糖苷酶 II (MAN2A1) 和 GlcNAcT-II (MGAT2) 导致双触角 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-聚糖，适合通过进一步工程化附加半乳糖和唾液酸。一些酵母物种，包括巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），不含 UDP-Gal，并且所有酵母都缺乏合成 CMP-Neu5Ac 的天然能力，因此需要进行大量的工程化，引入多个基因才能获得成熟的复杂N-聚糖。尽管工程化在计算机上看起来很简单，但已投入大量精力来确定在催化效率和 ER/高尔基体靶向方面都最佳的嵌合基因构建体。

O-糖基化工程

酵母进行广泛的共翻译和翻译后ER蛋白质O-甘露糖基化，使用几种多肽甘露糖基转移酶（PMTs）。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）有六种 PMTs，只有一部分可以在不降低活力的前提下被敲除。蛋白质O-Man残基在高尔基体中经历聚甘露糖基化。多细胞真核生物也进行 O-甘露糖基化并表达两种 PMT 直系同源物，POMT1 和 POMT2，但它们的受体底物特异性更窄。然而，多细胞真核生物进行其他几种类型的 O-糖基化，并且它们的 O-GalNAc 聚糖倾向于位于与酵母中 O-Man 聚糖相似的区域和蛋白质位点。这意味着在酵母中表达人类 O-糖蛋白可能导致在哺乳动物中携带 O-GalNAc 的位点发生 O-甘露糖基化。这方面的例子包括 IgA 的铰链区和粘蛋白序列。由于预测 O-糖基化类型仍然困难，因此必须对在酵母中表达的人类蛋白质进行测试，以确定它们是否被 O-甘露糖基化。

通过引入人类多肽 GalNAc-转移酶以及 UDP-Glc/GlcNAc C4-差向异构酶和**UDP-Gal/GalNAc 高尔基体转运体**，已成功将人类 O-GalNAc 聚糖工程化到酵母中。CMP-Neu5Ac合成和转运的整个生物合成机制也已与人类唾液酸转移酶一起引入，并且已在酵母中生产了唾液酸化O-聚糖。内源O-甘露糖基化竞争的问题可以通过包含甘露糖基转移酶抑制剂（罗丹宁-3-乙酸）部分消除。

【问题】需要更深入地了解酵母O-Man和人类O-GalNAc糖基化途径，以提供新的策略来规避这两个系统之间的竞争并增强酵母中的 O-聚糖工程。