【预备知识】
- 糖基化工程（Glycosylation Engineering） #191
- 细菌的糖生物学 #148
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最常用于异源蛋白生产的细菌，大肠杆菌，不具备对蛋白质进行糖基化的天然能力。然而，过去二十年的研究在致病性变形菌空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）和其他细菌物种中鉴定出了N-和O-糖蛋白以及负责其生物合成的糖基化途径。此外，几种细菌毒素具有糖基转移酶域，通过糖基化关键宿主蛋白质中高度特异性的氨基酸来干扰基本的细胞功能，从而发挥其致病性。
细菌的另一个独特特征是糖核苷酸供体在细胞质中合成并保留在细胞质中，因此工程化的聚糖组装在脂质载体上（用于基于整体（en bloc）糖基化的系统）或直接在蛋白质上（用于基于进程性（processive）糖基化的系统）必须发生在细胞质中，除非将核苷酸糖转运体导入周质膜。
游离和脂质连接寡糖的工程
细菌有效地生产游离和脂质连接的寡糖和多糖，包括荚膜多糖（CPSs）和脂多糖（LPSs），并且这些途径已被工程化以生产各种复杂的人类样聚糖。特别是，LPS途径已被用于在大肠杆菌中工程化和展示聚糖。LPS由一个核心寡糖连接的碱性脂质（脂质A）组成，其后是高度多样的O-多糖（O-抗原）。基因中断脂质A核心寡糖的生物合成可防止O-抗原的偶联，从而允许在脂质A上工程化新的聚糖以在细胞表面展示。此策略已用于工程化各种人类聚糖表位的合成，包括血型抗原和癌症相关糖脂聚糖。
在一个复杂的细菌中工程化大型游离复杂聚糖的例子中，通过删除一个果糖基转移酶（kfoE）、导入细菌UDP-Glc/-GlcNAc 4-差向异构酶和硫酸软骨素合成酶基因，并导入一个突变的人类软骨素-4-O-磺基转移酶基因，在大肠杆菌中生产了4-O-硫酸化硫酸软骨素（一种硫酸化糖胺聚糖），为在细菌中生产糖胺聚糖开辟了道路。
N-糖基化工程
某些细菌中存在两种类型的天然蛋白质N-糖基化，尽管在大肠杆菌中没有。第一种类型类似于真核细胞N-糖基化，在细胞质中产生脂质连接的寡糖，然后由寡糖基转移酶（OST）在周质中整体转移到天冬酰胺（Asn）上。空肠弯曲菌的OST，PglB，是与真核生物多蛋白OST复合体的催化STT3亚基相关的单个多肽。PglB 显示出比真核生物 N-X-S/T 更受限制的受体序列基序，要求一个酸性残基（D/EXNXS/T，其中 X 不能是 P）。这给工程化人类样N-聚糖的用途带来了一些限制，因为哺乳动物蛋白质中的大多数N-聚糖位点不符合此扩展的共有序列。已鉴定出来自其他物种的 PglBs 或通过适应性进化进化的突变体来解决此问题，但仍需要进一步改进。重要的是，PglB 具有相当宽松的供体底物特异性。尽管细菌的脂质连接寡糖与真核生物中的不同，但 PglB 可以使用哺乳动物型脂质连接寡糖作为供体。
使用原核生物进行糖工程的一个重要特点是整个糖基化机制在多基因操纵子中的排列。这使得10-20 kb的大型遗传元件可以在物种之间转移。一个主要的成就是将空肠弯曲菌的整个N-糖基化操纵子成功转移到大肠杆菌中，从而在大肠杆菌中产生了N-连接糖蛋白。通过引入真核酶已实现了携带 Man3GlcNAc2 核心N-聚糖的糖蛋白的生产。细菌N-连接糖基化正在被用作糖缀合物疫苗生产的替代方法，并且已开发出针对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的疫苗。
在 γ-变形菌中发现的另一种N-糖基化类型涉及一种胞质N-糖基转移酶（NGT），它靶向被哺乳动物OST识别的 N-X-S/T 受体序列基序。NGT 从活化糖核苷酸供体转移单个单糖（例如 Glc），具有松散的供体底物特异性，包括 UDP 和 GDP 糖核苷酸。这为工程化替代类型的N-糖基化提供了一种全新方法。在该途径中进行细菌工程导致了聚糖基序的组装，包括 α1-3-半乳糖表位 以及由 Glc 残基引发的岩藻糖基化和唾液酸化乳糖或**聚-N-乙酰乳糖胺（LacNAc）**单元在糖蛋白上。
尽管大多数细菌不具备唾液酸化的能力，但也有例外。CMP-唾液酸合成和具有与哺乳动物相似特异性的唾液酸转移酶的细菌基因已被导入质粒或整合到宿主细菌细胞的基因组中，从而能够生产唾液酸化N-和O-糖蛋白。
O-糖基化工程
一些细菌具有由糖基转移酶使用活化糖供体控制的进程性O-糖基化途径。这些途径启发了在大肠杆菌中工程化人类O-糖基化反应。通过引入哺乳动物多肽 GalNAc-转移酶基因和UDP-Glc/GlcNAc 4-差向异构酶，已实现了 O-GalNAc 蛋白糖基化。进一步引入**β1-3-半乳糖基转移酶使得能够在胞质受体蛋白上生物合成核心1 O-聚糖（T抗原）。GalNAc 残基的引入已用于表达后酶促添加聚乙二醇（PEG）衍生唾液酸**，以增强蛋白质药物的治疗特性。
其他细菌拥有的蛋白质O-糖基化机制与真核生物中O-聚糖的逐步生物合成不同，其中预组装的十一烯醇-PP-连接寡糖通过几种具有宽松供体底物特异性和了解甚少的受体底物特异性的 OSTs 整体转移到蛋白质上。内源糖基化机制的工程化已被用于整体转移人类O-GalNAc聚糖（Tn、T、唾液酸-Tn 和 唾液酸-T 抗原）到受体蛋白上（表56.1）。
