【预备知识】
- 糖基化在生物体中普遍存在 #92
糖基化工程（Glycosylation Engineering） 是一种通过基因工程或化学手段来改变细胞或生物体糖基化方式 的技术，用于控制、设计或优化蛋白质和细胞表面的聚糖结构，从而影响它们的功能、稳定性或与其他分子的相互作用。
在哺乳动物细胞、植物、真菌（酵母）和细菌中进行糖基化工程已有较长的历史，并且有许多特性明确的糖基化突变体可用。
糖基化工程用于制备功能性糖蛋白
- 细胞糖工程常用于生产需要糖基化才能发挥功效的重组治疗性糖蛋白，同时这些糖蛋白必须具有人兼容性糖基化，以避免对非人聚糖产生免疫反应。糖基化可以改变治疗性糖蛋白的大小、电荷和溶解度，从而防止其在循环中被快速清除。
- 糖工程已被用于改进或开发新的治疗模式。
- 聚糖也可以作为凝集素受体的配体，将治疗药物靶向特定的细胞。N-糖基化对于IgG抗体的效应功能尤其重要；经过设计以改善其细胞毒性特性的具有N-糖基化的治疗性IgG抗体已在临床中使用。
图 Essentials of Glycobiology, 4E. Fig. 56.1：物种特异性糖基化特征概述。该图展示了哺乳动物、植物、昆虫和酵母细胞中存在的不同类别的糖缀合物，以及每种类别的一个代表性糖链。断裂线（break）右侧的结构存在于所示生物体的细胞质和细胞核中。细菌和古细菌（未显示）的糖链种类更加多样化，并且通常含有非人类的单糖。
不同物种的糖基化能力在聚糖附着位点和所附着聚糖方面存在显著差异。因此，糖工程策略的第一步是考虑使用哪种细胞类型。这个决定需要对糖基化途径和基因有详细的了解。
用于表达重组糖蛋白的最常见细胞系包括酵母、植物、昆虫细胞、非人哺乳动物细胞，以及相对不常用的人细胞。最近，细菌也正在被改造以适应糖蛋白的生产。
从历史上看，哺乳动物中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系一直发挥着主导作用，如今大多数生物制品都在CHO细胞中生产。选择CHO细胞系进行人类治疗药物生产，是因为其糖基化能力相对简单且与人类相似。CHO细胞系产生相对狭窄的聚糖谱，这些聚糖在人类中不具有免疫原性；糖工程可以扩展其天然糖基化能力并提供糖型的优化。也可以选择其天然糖基化（或缺乏）为工程化提供更简单起点的替代宿主物种。例如，用于酶替代疗法的糖蛋白已在酵母中生产，而聚糖疫苗已在细菌中生产。
尽管不同物种的糖组具有不同的特征，但真核生物的基本生物合成机制和途径却惊人地保守，甚至与某些细菌和古菌中的糖基化途径也有相似之处。
跨物种的糖工程仍处于起步阶段。虽然在异源宿主中表达特定蛋白质可能只需要导入该蛋白质的单个基因，但对该蛋白质进行精确的糖基化工程可能需要导入一套基因，包括合成和转运适当活化核苷酸糖供体所需的基因以及多种糖基转移酶。
成功的糖工程需要了解指导特定聚糖合成所需的糖基转移酶基因和底物。可能需要移除某些基因并插入其他基因，以创建产生目标聚糖的生物合成途径。不同的糖基化途径可以使用不同的酶集独立运作，或者在某些情况下可以共享酶。以连续顺序组装成熟聚糖的酶通常独立运作，尽管也可能存在协同效应。原则上，我们有足够的知识来预测单个酶的作用并将其分配给特定的途径，从而允许预测在特定糖缀合物上产生特定聚糖所需的酶库。一个很好的资源是糖活性酶（CAZy）数据库中对来自不同物种的同源基因家族的分类。
在选定的宿主中进行所需聚糖的糖工程的先决条件之一是存在适当的活化糖供体及其转运体库。当在原核生物或非哺乳动物真核生物中进行糖基化工程时，这一点尤为重要，因为它们可能不具备合成具有人类糖基化疗法所需的核苷酸糖供体。例如，酵母不产生UDP-GalNAc，并且许多生物体不产生CMP-唾液酸。
糖基化工程用于糖科学研究
CHO Lec、Ldl、Pgs 和 Pig突变细胞系通过提供糖基化的明确改变为研究界服务了数十年，从而能够研究聚糖的功能作用。例如，缺乏 MGAT1 的 CHO 和 HEK293-T 突变细胞已被广泛用于生产具有均一N-聚糖的重组蛋白，适合结晶研究。
此外，靶向整个生物体中的糖基化基因为深入了解糖基化的重要性提供了巨大洞察力，并揭示了特定糖基化基因的生物学功能。然而，特定聚糖的不同生物学功能以及多细胞生物中涉及的分子机制的发现被细胞类型对糖基化的调控和组织的细胞异质性所复杂化。细胞系有助于回答某些特定问题并补充整个生物体的研究。
精确基因编辑为糖工程化细胞系和设计探索聚糖功能的新策略提供了巨大机会。
- SimpleCell策略通过截断O-聚糖延伸，生产均一的简单O-糖蛋白组，从而实现O-GalNAc和O-Man糖蛋白组的高灵敏映射。
- 仅在一个糖基转移酶基因上不同的同基因细胞系，能用于比较特定聚糖或糖基化途径的功能。
- 靶向COSMC伴侣蛋白可截断O-GalNAc聚糖，诱导人类角质形成细胞出现类癌变行为，这与癌症中Tn和STn抗原的过表达相关。
- 大型同基因细胞库已被用于细胞表面聚糖阵列研究，帮助解析糖脂、N-聚糖、O-GalNAc、O-Fuc、O-Glc等聚糖在人类组织形成中的复杂功能。
一个相关的方法是使用糖工程来发现微生物和病毒感染所需的宿主聚糖。在一项非凡的研究中，使用拉沙病毒与单倍体细胞系的结合，鉴定了拉沙病毒结合的扩展 O-Man 聚糖（称为基质聚糖）合成所需的大量聚糖基因，并使用病毒抗性选择和 TALEN 介导的基因敲除相结合进行了验证。
表 细胞糖基化工程的主要成就举例
| Cell | Gene modification | Effect | Purpose | Structure |
|---|
| Mammalian | | | | |
| CHO | KO of Fut8 | Elimination of core fucose | IgG1 with increased binding affinity ti FcγRIIIa and ADCC |  |
| CHO | OE of MGAT3 | Reduction of core fucose by addition of bisecting GlcNAc | IgG1 with increased binding affinity ti FcγRIIIa and ADCC |  |
| CHO | KO combinations of 19 glycosyltransferses KI ST6GAL1 | N-glycan deconstruction and construction controlling branching, polyLacNAc, and sialylation | Design matrix to create homogeneous N-glycans of choice |  |
| CHO | OE of GDP-6-deoxy-D-lyxo-4-hexulose reductase (Pseudomonas aeruginosa rmd gene) | Depletes endogenous GDP-Fuc and provides control of fucosylation by exogenous addition of fucose | IgG1 with increased binding affinity to FcγRIIIa and ADCC |  |
| CHO | KO of Fut8 and B4galt1, KI of integrated circuits expressing synthetic glycosyltransferase genes under constitutive or inducible promoters | Small molecule control of antibody fucosylation and galactosylation levels | IgG1 with increased binding affinity to FcγRIIIa and ADCC |  |
| HEK293 | KO of MGAT1 combined with Golgi-targeted expression of endo-β-N-acetylglucosaminidases | Single GlcNAc N-glycan “stumps” that can be recognized and modified by galactosyltransferases and sialyltransferases | Simple and homogenous N-glycosylation |  |
| Insect | | | | |
| S2 Drosophila melanogaster cells | KI of sialic acid synthase, CMP-sialic acid synthase, CMP-sialic acid transporter, and a N-acetylglucosamine-6-phosphate 2'-epimerase | Biantennary N-glycans with galactosylation and sialic acid | Human-like N-glycans in insect cells |  |
| Yeast | | | | |
| Yarrowia lipolytica | KO of och1, KI of mnn4 | N-linked glycans with mannose- 6-phosphates; uncapping can be performed in vitro with glycosidases and α-mannosidases | Lysosomal targeting of enzymes used for enzyme replacement in lysosomal storage diseases |  |
| Pichia pastorius | KO of ochl, pnol, mnn4B, bmt2; KI of 14 genes: UDP-GlcNAc transporters, MnsI, MGAT1, MGAT2, Mnsll, Gal epimerase, UDP-Gal transporter, B4GALT1, and sialic acid biosynthetic pathway, and transporters | Biantennary N-linked glycans with sialylation | Human-like N-glycans in yeast |  |
| P. pastorius | KO of ochl; OE of MGAT1, B4GALT1 targeted to Golgi and α2- mannosidase retained in the endoplasmic reticulum | Biantennary N-linked glycans | Human-like N-glycan core in yeast |  |
| Saccharomyces cerevisiae | KO of ALG3 and ALG11 and OE of artificial flippase and protozoan OST | Lipid-linked Man3GIcNAc2 assembled on cytoplasmic side of endoplasmic reticulum, flipped and transferred to protein | Mammalian core Man3GIcNAc2 |  |
| Bacteria | | | | |
| Escherichia coli | KI of OST pgIB from Campylobacter jejuni together with four glycosyltransferases from S. cerevisiae encoded by ALG1, ALG2, ALG13, and ALG14 | Introduce N-glycosylation into major prokaryotic production organism | Mammalian core Man3GlcNAc2 |  |
| E. coli | OE/KI of OST pgIB and NeuBCA enzymes from C. jejuni, LsgCDEF glycosyltransferases from Haemophilus influenza, and α2-6 sialyltransferase from Photobacterium leiognathi | Introduce Neu5Acα2-6GaIβ1-4GIcNAc termini to N-linked glycans | Simplified sialylated N-linked glycans |  |
| E. coli | OE/KI of OST pgIB and select pgl cluster genes from Campylobacter jejuni | Introduce distinctive N-linked glycan that can be trimmed to GlcNAc-Asn for chemoenzymatic elongation | Scaffold for human-like N-glycans |  |
| E. coli | OE/KI of OST PglO from Neisseria gonorrhoeae or PglL from Neisseria meningitidis | Introduce GaINAc O-glycosylation into major prokaryotic production organism | Mammalian-type Tn, T, siaIyI-Tn, and siaIyI-T glycans |  |
| Plants | | | | |
| Nicotiana tabacum | KO of β-hexosaminidase, α3-fucosyltransferase, and β2-xylosyltransferase; KI of B4GALT1, ST6GAL1, CMP-sialic acid synthase, and transporters | Production of biantennary N-glycans with α2-6NeuAc and without core fucose | Human-like N-glycans in plants |  |
| N. tabacum | KO of β-hexosaminidase, α3-fucosyItransferase, and β2-xyIosyItransferase; OE of GALNT2, C1GALT1, ST3GAL1, SLC35A1, e1/2, ST6GALNAC3/4 | Introduce N-glycosylation into major prokaryotic production organism | Mammalian-type Tn, T, siaIyI-Tn, and siaIyI-T glycans |  |
(KO) knockout, (OE) overexpression, (KI) knock-in, (CMP) cytidine monophosphate, (OST) oligosaccharyl transferase, (ADCC) antigen-dependent cellular cytotoxicity.
Essentials of Glycobiology, 4E. TABLE 56.1.
真核生物的基因糖工程策略
可以使用不同的遗传策略来改变细胞的糖基化能力。在真核生物中，基因敲低和非靶向过表达已使用了多年，而精确靶向基因编辑策略现已成熟。
敲低（Knockdown）
通过基因沉默策略已实现在细胞中减少不希望的糖基转移酶活性。尽管这在植物和果蝇中特别成功，但沉默尚未在哺乳动物细胞系糖工程中广泛应用，因为敲低的低效率通常会残留不希望的目标糖基转移酶活性水平。
过表达（Overexpression）
向真核细胞中添加所需的糖基转移酶活性是通过转染来自任何生物体的聚糖基因、质粒DNA的随机整合以及抗生素选择稳定克隆来实现的。尽管此策略是成功的，但它无法控制基因组整合位点、基因拷贝数或基因表达水平（除非使用特定策略）。酶的过表达可能导致正常糖基化模式的破坏和不可预测的糖基化。导入的糖基化基因的不稳定性和抗生素选择的使用也给这种工程化细胞用于生产治疗性糖蛋白的长期使用带来了问题。
精准基因组编辑：敲除（Knockout）和敲入（Knock-In）
糖基化基因敲除在细菌和酵母中长期以来是一项简单的任务。随着基于核酸酶的精确基因编辑工具的引入，真核细胞基因敲除或敲入的困难也大大减少。这些工具包括锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）和成簇规律间隔短回文重复/靶向Cas9核酸内切酶（CRISPR/Cas9）。这些工具也可用于激活内源性沉默基因、编辑基因序列以模拟低效（hypomorphic）疾病突变，以及将外源基因插入特定的基因组位点。
