【基础】
- N-聚糖（N-Glycans） #136
- 真核生物分泌途径中的糖基化 #93
N-聚糖生物合成发生在真核细胞的两个阶段和两个区室中：内质网（ER）和高尔基体（Golgi）。
第一阶段是一个高度保守的途径，在 ER 膜上以脂质载体磷酸多萜醇（Dol-P）进行。在分泌和膜蛋白转运到 ER 期间，组装在 Dol-P 上的寡糖被整体转移到选定的 Asn-X-Ser/Thr 糖基化基序的 Asn 上。
第二阶段始于 ER 腔内糖苷酶和糖基转移酶对 N-聚糖的加工，并以物种特异性、细胞类型特异性、蛋白质特异性甚至位点特异性的方式在高尔基体中继续。许多糖苷酶和糖基转移酶差异表达，其活性对细胞的生理状态极其敏感。所有糖基转移酶都使用活化的糖（核苷酸糖、多萜醇糖）作为底物。因此，成熟的糖蛋白携带的 N-聚糖取决于制造该糖蛋白的细胞类型中表达的糖基化基因的互补性，以及影响糖基化酶和核苷酸糖转运体定位和活性的该细胞的生理状态。
多萜醇连接前体的合成（Synthesis of the Dolichol-Linked Precursor）
多萜醇是由五个碳的异戊二烯单元组成的聚异戊二烯。最常见的酵母多萜醇有 14 个异戊二烯单元，而包括哺乳动物在内的其他真核生物的多萜醇可能有多达 19 个异戊二烯单元。
图. 磷酸多萜醇（Dol-P）
N-聚糖合成始于将 GlcNAc-1-P 从 UDP-GlcNAc 转移到 Dol-P 上，生成多萜醇焦磷酸 N-乙酰氨基葡萄糖（Dol-P-P-GlcNAc）。该反应被**衣霉素（tunicamycin）**抑制，从而阻断 N-聚糖合成。
对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的遗传研究已经确定了保守的 ALG（Asn-连接糖基化）位点，它们编码了真核生物中脂质连接寡糖组装的生物合成机制。
图. Dol-P-P-GlcNAc2Man9Glc3 的合成
- 位于内质网（ER）膜细胞质面的磷酸多萜醇（Dol-P，红色波浪线）从细胞质中的 UDP-GlcNAc 接收 GlcNAc-1-P，生成 Dol-P-P-GlcNAc。
- Dol-P-P-GlcNAc 延伸至 Dol-P-P-GlcNAc2Man5 后，被“翻转”穿过 ER 膜到腔侧。
- 随后，从 Dol-P-Man 添加四个 Man 残基，从 Dol-P-Glc 添加三个 Glc 残基。
- Dol-P-Man 和 Dol-P-Glc 也在 ER 膜的细胞质侧制成并“翻转”到腔侧。
酵母中有缺陷的 alg（天冬酰胺连接糖基化）基因突变体被用于鉴定负责许多反应的 ALG 酶。这个 14 个糖的寡糖通过一个由 8-9 个跨膜蛋白组成的寡糖基转移酶复合体（OST）转移到 N-X-S/T 基序内的 Asn 侧链上。在哺乳动物细胞中，OSTA 复合体与 ER 膜中的转位子相关联，并优先糖基化穿过转位子的新生多肽**，而 OSTB 复合体则修饰已离开转位子并位于 ER 腔内的蛋白质。酶名称来自人类基因命名委员会（HGNC）。
第一步由 ALG7（哺乳动物中的 DPAGT1）催化，这是一种 GlcNAc-1-磷酸转移酶，将 GlcNAc-1-P 从 UDP-GlcNAc 转移以形成 Dol-P-P-GlcNAc。衣霉素是一种该酶的抑制剂，用于抑制细胞中的 N-糖基化。随后，第二个 GlcNAc 和五个 Man 残基分别从 UDP-GlcNAc 和 GDP-Man 转移，在 ER 膜的细胞质侧生成 Man5GlcNAc2-P-P-Dol。所有这些酶都只转移核苷酸糖的糖部分。Man5GlcNAc2-P-P-Dol 前体通过酵母中由 RFT1 位点编码的**“翻转酶”（flippase）穿过 ER 膜双层转位。Man5GlcNAc2-P-P-Dol 通过添加四个 Man** 和三个 Glc 残基进行延伸，这些残基分别从 Dol-P-Man 和 Dol-P-Glc 转移。Dol-P-Man 和 Dol-P-Glc 供体在 ER 膜的细胞质侧由 GDP-Man 和 UDP-Glc 形成。Dol-P-Man 和 Dol-P-Glc 也必须翻转穿过 ER 膜。哺乳动物 MPDU1 是一种 ER 膜蛋白，对于 ER 腔内 Dol-P-Man 和 Dol-P-Glc 在合成成熟 N-聚糖前体 Glc3Man9GlcNAc2-P-P-Dol 中的利用是必需的。这个 14 个糖的糖链由**寡糖基转移酶（OST）**转移到已转运穿过 ER 膜的蛋白质区域中接受性的 Asn-X-Ser/Thr 基序的 Asn 上。
多萜醇连接前体向新生蛋白质的转移
（Transfer of the Dolichol-Linked Precursor to Nascent Proteins）
OST 是 ER 膜中的一个多亚基蛋白质复合体，动基体生物除外。
OST 催化寡糖从 Dol-P-P 转移到新合成的蛋白质区域中的 Asn-X-Ser/Thr 上，这些蛋白质区域在通过转位子进入 ER 时。OST 对完全组装好的寡糖具有高特异性，在大多数真核生物中为 Glc3Man9GlcNAc2。当组装不完整的寡糖时，转移效率降低，导致成熟糖蛋白出现空 N-聚糖位点的糖基化不足。所有 OST 亚基都是具有一到十三个跨膜结构域的跨膜蛋白。OST 复合体裂解高能 GlcNAc-P 键，同时释放 Dol-P-P。
酵母 OST 由八个不同的亚基组成：Stt3p、Ost1p、Wbp1p、Swp1p、Ost2p、Ost4p、Ost5p 和 Ost3p 或 Ost6p。Stt3p 是该酶的催化亚基。两个 OST 复合体（含硫氧还蛋白亚基 Ost3p 或 Ost6p）具有不同的蛋白质-底物特异性。OST 的复杂性在多细胞生物中增加。在哺乳动物中，有两个不同的催化 STT3 亚基，它们都与 ribophorins I 和 II、OST48、OST4 和 DAD1 蛋白质（分别是酵母 Ost1p、Swp1p、Wbp1p、Ost4p 和 Ost2p 的同源物）相关联。与转位子紧密相关的 STT3A 复合体（OSTA）含有 KCP2 和 DC2 亚基，而含有 MAGT1 或 TUSC3（酵母 Ost3p/Ost6p 的同源物）的 STT3B 复合体（OSTB）在多肽转运到 ER 后进行翻译后糖基化。在结合到催化 STT3 亚基时，客户肽会发生 180° 转折，使得多肽折叠成为 N-糖基化的竞争反应。事实上，OST 复合体的硫氧还蛋白亚基（Ost3p/Ost6p；MAGT1/TUSC1）调节客户多肽的氧化折叠，从而扩展了 OST 的多肽底物范围。
截至 2021 年 2 月，UniProt 数据库报告了酵母中有 1911 个 N-糖基化位点，小鼠糖蛋白中有 13,648 个。
早期加工步骤：从 Glc3Man9GlcNAc2Asn 到 Man5GlcNAc2Asn
在 14 个糖的糖链共价连接到蛋白质中的 Asn-X-Ser/Thr 上后，加工反应在 ER 中修剪 N-聚糖。初始步骤通过与识别修剪后 N-聚糖特定特征的 ER 伴侣蛋白相互作用，在调节糖蛋白折叠中具有关键作用。
图 9.4. N-聚糖的加工和成熟
连接到 Dol-P-P 上的成熟糖链通常在蛋白质合成过程中，当蛋白质正在转运到内质网（ER）时，被转移到 Asn-X-Ser/Thr 基序的 Asn 上。一些转移在转运完成后也会发生。在将 Glc3Man9GlcNAc2 转移到蛋白质上后，ER 中的葡萄糖苷酶去除三个 Glc 残基，ER 甘露糖苷酶去除一个 Man 残基。这些反应与在钙联集素和钙网织蛋白凝集素以及 UDP-葡萄糖:糖蛋白葡糖基转移酶（UGGT）协助下的糖蛋白折叠密切相关，它们共同决定了带有 Man9GlcNAc2 的糖蛋白是继续进入高尔基体还是被降解。对于 ER 中错误折叠的蛋白质，ER 降解增强型 α-甘露糖苷酶 I 样蛋白（EDEMs）修剪 Man 会导致 Man7GlcNAc2 N-聚糖的形成，该聚糖被凝集素 OS9 识别，后者通过逆向转运将其护送到细胞质中进行降解。第一个 Glc（因此是所有 Glc）的去除可以通过栗精胺在实验上被阻断，留下 Glc3Man9GlcNAc2，随后在穿过高尔基体时可能会去除末端的 Man 残基。对于大多数糖蛋白，更多的 Man 残基在高尔基体顺式腔中被一系列甘露糖苷酶（MAN1A1、MAN1A2、MAN1C1）去除，直到生成 Man5GlcNAc2。甘露糖苷酶抑制剂脱氧甘露霉素和壳孢素会阻断这些 Man 残基的去除，留下 Man9GlcNAc2，该聚糖在高尔基体中不再进一步加工。MGAT1 在高尔基体中间腔对 Man5GlcNAc2 的作用启动了复合型或杂合型 N-聚糖的第一个分支。该反应在 Lec1 CHO 突变体中被阻断，其中 MGAT1 失活，留下 Man5GlcNAc2，该聚糖不再进一步加工。α-甘露糖苷酶 II 活性由 MAN2A1 或 MAN2A2 催化，在可被抑制剂泽西霉素阻断的反应中去除两个外部 Man 残基。α-甘露糖苷酶 II 的作用为 MGAT2 产生底物。由此产生的双触角（antennae，或译为天线） N-聚糖通过添加 Fuc、Gal 和 Sia 进行延伸，生成具有两个分支的复合型 N-聚糖。在 Lec8 CHO 突变体中，Gal 的添加不会发生，该突变体具有失活的 UDP-Gal 转运体。因此，在 Lec8 突变体中，复合型 N-聚糖以 GlcNAc 终止。在 Lec2 CHO 突变体中，Sia 的添加不会发生，该突变体具有失活的 CMP-Sia 转运体。在 Lec2 突变体中，复合型 N-聚糖以 Gal 终止。复合型 N-聚糖可以具有比图中所示更多的糖，包括连接到核心的额外残基、额外的分支、用聚-LacNAc 单元延伸的分支，以及不同的**“加帽”表位**。图中还显示了溶酶体水解酶的特殊情况，它们在高尔基体顺式腔中通过 N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶（GNPTAB 和 GNPTG 的异二聚体）在寡甘露糖 N-聚糖的 Man 残基的 C-6 处获得一个 GlcNAc-1-P。GlcNAc 在高尔基体反式腔中被磷酸二酯 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGPA）去除，从而暴露出被 Man-6-P 受体（M6PR）识别的 Man-6-P，并被引导到一个酸化的溶酶体前区室。（Kornfeld R, Kornfeld S. 1985. Annu Rev Biochem 54: 631–634。）
对 Glc3Man9GlcNAc2Asn 的加工始于 α-葡萄糖苷酶 I（MOGS）和 II（GANAB）对 Glc 残基的顺序去除。两种葡萄糖苷酶都在 ER 腔内发挥作用，其中 α-葡萄糖苷酶 I 特异性作用于末端 α1–2Glc，而 α-葡萄糖苷酶 II 顺序去除两个内部 α1–3Glc 残基。在蛋白质折叠过程中，Glc 残基的去除和最内部 α1–3Glc 的短暂重新添加有助于 ER 滞留时间。可以通过使用葡萄糖苷酶 I 抑制剂（如栗精胺或脱氧野尻霉素）在实验上阻止 Glc 残基的去除。抑制后，N-聚糖保留了三个 Glc 残基，并在穿过 ER 和高尔基体时通常会失去一个或两个 Man 残基，导致成熟糖蛋白上出现 Glc3Man7–9GlcNAc2 N-聚糖。在离开 ER 之前，ER α-甘露糖苷酶 I（MAN1B1）去除 Man9GlcNAc2 中央臂上的末端 α1-2Man，产生 Man8GlcNAc2 异构体。EDEM 甘露糖苷酶对错误折叠的糖蛋白上的末端 α1-2Man 残基的缓慢裂解，导致 OS9 识别修剪后的糖链，并将其靶向 ER 降解。大多数离开 ER 进入高尔基体的糖蛋白携带具有八个或九个 Man 残基的 N-聚糖。
由于 ER 中加工不完全，高尔基体顺式腔中的一些 N-聚糖保留了一个 Glc 残基。在这种情况下，高尔基体末端 α-甘露糖苷酶（MANEA）在 Glcα1-3Manα1-2Manα1-2 部分的两个 Man 残基之间内部裂解，从而产生一个不同于 ER α-甘露糖苷酶 I（MAN1B1）产生的 Man8GlcNAc2 异构体。α1-2Man 残基的修剪在高尔基体顺式腔中通过 α1-2 甘露糖苷酶 IA、IB 和 IC（MAN1A1、MAN1A2、MAN1C1）的作用继续进行，生成 Man5GlcNAc2，这是通向杂合型和复合型 N-聚糖的关键中间体。一些 Man5-9GlcNAc2 糖链也可能逃脱进一步的修饰。在这些情况下，成熟的膜或分泌糖蛋白将携带 Man5–9GlcNAc2 N-聚糖。
此外，MAN1B1、MAN1A1、MAN1A2 和 MAN1C1 的作用都可以通过抑制剂脱氧甘露霉素或壳孢素在实验上被阻断，导致成熟糖蛋白上出现 Man8-9GlcNAc2。
大多数成熟糖蛋白有一些在高尔基体顺式腔中未被加工的寡甘露糖型 N-聚糖。
后期加工步骤：从 Man5GlcNAc2Asn 到杂合型和复合型 N-聚糖
杂合型和复合型 N-聚糖的生物合成在高尔基体中间腔中开始，通过一种称为 GlcNAc-TI（MGAT1）的 N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶的作用，该酶将一个 GlcNAc 残基添加到 Man5GlcNAc2 核心中 α1-3Man 的 C-2 上。
随后，大多数 N-聚糖在高尔基体中间腔中被 α-甘露糖苷酶 II 酶（MAN2A1 或 MAN2A2）修剪，这些酶从 GlcNAcMan5GlcNAc2 中去除末端 α1-3Man 和 α1-6Man 残基，形成 GlcNAcMan3GlcNAc2。需要注意的是，α-甘露糖苷酶 II 除非经过 MGAT1 的作用，否则不能修剪 Man5GlcNAc2。一旦两个 Man 残基都被去除，第二个 GlcNAc 通过 GlcNAc-TII（MGAT2）的作用被添加到 N-聚糖核心中 α1-6Man 的 C-2 上，生成所有双触角、复合型 N-聚糖的前体。如果由 MGAT1 产生的 GlcNAcMan5GlcNAc2 糖链未被 α-甘露糖苷酶 II 作用，则形成杂合型 N-聚糖。α-甘露糖苷酶 II 的不完全作用可能导致 GlcNAcMan4GlcNAc2 杂合体。
小型寡甘露糖型 N-聚糖已在无脊椎动物和植物中发现了相对较大的量。这些 Man3–4GlcNAc2 N-聚糖（贫甘露糖型 N-聚糖 paucimannose）是在 α-甘露糖苷酶 II 作用后，通过高尔基体己糖胺酶去除外围 GlcNAc 后由 GlcNAcMan3–4GlcNAc2 形成的。贫甘露糖型聚糖也在哺乳动物中发现，并且在癌症、炎症和干细胞发育中可能升高。
高尔基体中间腔所示的复合型 N-聚糖具有两个通过添加两个 GlcNAc 残基启动的触角或分支。可以通过 GlcNAc-TIV（MGAT4A、MGAT4B、MGAT4C）在核心 α1-3Man 的 C-4 处启动额外的分支，并通过 GlcNAc-TV（MGAT5）在核心 α1-6Man 的 C-6 处启动额外的分支，从而产生三触角和四触角 N-聚糖（图 9.5）。MGAT5B 或 GlcNAc-TIX 催化相同的反应，但优先作用于大脑中的 O-甘露糖聚糖。在鸟类和鱼类中发现的另一个分支可以通过 GlcNAc-TVI（MGAT6；图 9.5）在核心 α1-6Man 的 C-4 处启动。与 GlcNAc-TVI 相关的基因存在于哺乳动物基因组中（MGAT4C）。复合型和杂合型 N-聚糖还可以携带一个“二分” GlcNAc 残基，该残基通过 GlcNAc-TIII（MGAT3）连接到核心的 β-Man 上（图 9.5）。图 9.5 中显示了双触角 N-聚糖上的二分 GlcNAc，它可能存在于所有高度分支的 N-聚糖中。然而，它通常不会被延伸。
图 9.5. 复合型 N-聚糖的分支和核心修饰
图 9.4 中所示的杂合型和成熟的双触角复合型 N-聚糖可能包含更多的分支，因为高尔基体中的 GlcNAc-转移酶只在 MGAT1 作用后才起作用。如果 α-甘露糖苷酶 II 酶（MAN2A1 或 MAN2A2）不作用，则产生杂合型 N-聚糖。当甘露糖苷酶作用时，MGAT2 产生双触角 N-聚糖。该底物可以接受来自 MGAT3 的二分 GlcNAc，或来自 FUT8 的 Fuc，或来自分支酶 MGAT4A、MGAT4B、MGAT5 或 MGAT5B 的 GlcNAc（在哺乳动物中）。MGAT6 存在于鸟类和鱼类中，并可能存在于哺乳动物中。每个 GlcNAc 分支都可以用 Gal、GlcNAc、Sia 和 Fuc 延伸。二分 GlcNAc 通常不会被延伸，除非 MGAT2 缺失。核心 Fuc 在哺乳动物中不会被延伸。图中显示了每一步转移的糖的连接。
N-聚糖的成熟（Maturation of N-Glycans）
进一步的糖添加将有限的杂合型和分支 N-聚糖库转化为广泛的成熟复合型 N-聚糖阵列，包括 ：
- 向 N-聚糖核心添加糖，
- 通过添加糖来延伸分支 GlcNAc 残基
- 延伸分支的“加帽”（“capping”）或“装饰”（“decoration”）。
脊椎动物 N-聚糖中主要的核心修饰是向 N-聚糖核心中 Asn 连接的 GlcNAc 添加 α1-6Fuc。α1-6 岩藻糖基转移酶（FUT8）通常需要 MGAT1 的预先作用。
在无脊椎动物糖蛋白中，两个核心 GlcNAc 残基都可能以 α1–3 和/或 α1-6 连接接收 Fuc。
在植物中，Fuc 仅以 α1-3 连接转移到 Asn 连接的 GlcNAc 上。
此外，在植物和蠕虫糖蛋白中，向核心 β-Man 添加 β1-2Xyl 是常见的。这种木糖基转移酶也需要 MGAT1 的预先作用。木糖尚未在脊椎动物 N-聚糖中检测到。
大多数复合型和杂合型 N-聚糖具有延伸的分支，这些分支是通过向启动 GlcNAc 添加 Gal 来制成的，从而产生普遍存在的构建块 Galβ1-4GlcNAc，被称为类型-2 N-乙酰乳糖胺或“LacNAc”序列。
LacNAc 二糖的顺序添加产生称为聚-LacNAc 的串联重复。在某些糖蛋白中，β 连接的 GalNAc 代替 Gal 添加到 GlcNAc 上，产生具有 GalNAcβ1–4GlcNAc（LacdiNAc）延伸的触角。
图 9.6. 成熟糖蛋白上典型的复合型 N-聚糖
任何分支上的 LacNAc 单元（括在括号中）可以重复多次。
最重要的**“加帽”反应涉及向复合型 N-聚糖分支添加 Sia、Fuc、Gal、GlcNAc 和硫酸盐。加帽糖最常见是 α 连接的，因此从 β 连接的聚-LacNAc 分支向外突出**，从而促进末端糖向凝集素和抗体的呈递。许多这些结构由 N-和 O-聚糖以及糖脂共享。末端唾液酸可以有进一步的化学修饰（例如，O-乙酰化）。
上述各种反应可能产生无数的复合型 N-聚糖，它们在分支数、组成、长度、加帽排列和核心修饰方面有所不同。图 9.6 中显示了一些说明这种多样性的示例。
N-聚糖合成中的转移酶和转运体
（transferases and transporters in n-glycan synthesis）
ER 中的糖基转移酶主要是编织到 ER 膜中的多跨膜蛋白。相比之下，高尔基体区室中的糖基转移酶通常是 II 型膜蛋白，具有一个小的细胞质氨基末端结构域、一个单一跨膜结构域和一个大的腔内结构域，后者包括一个从膜延伸出来的细长茎区和一个球状催化结构域。茎区通常被信号肽肽酶样蛋白酶（特别是 SPPL−3）裂解，将催化结构域释放到高尔基体腔内并允许其分泌。因此，许多糖基转移酶的细胞外可溶形式存在于组织和血清中，并且如果细胞外存在核苷酸糖，它们可以作为转移酶发挥功能。
核苷酸糖在细胞质中合成，除了在细胞核中合成的 CMP-唾液酸外。随后，它们通过专门的核苷酸糖转运体转运穿过膜后，被浓缩到适当的区室中，这些转运体转运 CMP-Sia、UDP-Gal、UDP-Glc、UDP-GlcNAc、GDP-Fuc 和其他核苷酸糖。其中一些转运体可以转运不止一种核苷酸糖。每个转运体都是一个通常包含 10 个跨膜结构域的多跨膜蛋白。一些 CMP-唾液酸在转移到糖链受体之前，可以在高尔基体腔内通过 O-乙酰基团进一步修饰。
