【预备知识】
基于质谱的分泌蛋白组学（MS-based Secretomics）
细胞可将蛋白质分泌至细胞外环境，其中大多数蛋白通过经典分泌途径（classical secretory pathway）糖基化修饰。这些糖蛋白在细胞信号传导和细胞间通讯中发挥关键作用。
Uhlén 等人（2019）[10.1126/scisignal.aaz0274] 结合抗体检测与质谱分析，基于信号肽或跨膜结构域的存在，建立了人类分泌蛋白数据库，发现约有 2641 个基因编码潜在的分泌蛋白，约占全部人类蛋白编码基因的 13%。
根据 UniProt 的注释，66% 的分泌蛋白是糖基化的[10.1038/emboj.2012.173]。
传统抗体方法难以实现大规模分析，也无法揭示糖基化位点或糖链结构信息。相比之下，质谱蛋白质组学能够在更大范围内识别并定量分泌糖蛋白，但仍存在动态范围宽、样品复杂度高等挑战。
以下为主要的实验策略：
1. 广泛且多维分级（Extensive and Multidimensional Fractionation）
血清或培养基中蛋白浓度差异可达 10⁹ 倍。如白蛋白浓度极高（达每升数十克），而部分信号蛋白仅在微克或更低水平[10.1016/j.jprot.2009.07.001][10.1177/0004563215593561]。
由于质谱（特别是 DDA 模式）对高丰度肽段敏感，低丰度分泌蛋白往往难以检测[10.1186/1479-5876-9-113]。
通过正交多维分级可降低复杂性并提高低丰度蛋白检测灵敏度。
例如 Dey 等人（2019）[10.1186/s12014-019-9237-1] 在分析约 5000 种蛋白时耗时超过 500 小时。
2. 高丰度蛋白耗竭（Depletion of Highly Abundant Proteins）
通过抗体亲和柱去除高丰度蛋白（如白蛋白、免疫球蛋白等）可提升检测深度[10.1038/s41598-018-24270-w][10.1021/pr900845m]。
但该方法可能引起样本损失、非特异结合、定量误差及重复性问题[10.1021/pr100646w]。
白蛋白可与多种分泌蛋白结合，去除后可能导致目标蛋白流失[10.1002/pmic.200401331]。
3. 无血清培养（Serum Starvation）
短期无血清培养可避免外源血清蛋白干扰，但细胞饥饿效应可能改变分泌谱或诱导细胞死亡[10.1002/elps.201400100]。
Eichelbaum 等人（2012）使用 AHA 标记和 脉冲 SILAC 方法识别了 1000 多种新合成分泌蛋白[10.1038/nbt.2356]。
4. 凝集素富集（Lectin-based Enrichment）
凝集素通过识别特定糖链富集糖蛋白。
Boersema 等人（2013）[10.1074/mcp.M112.023614] 使用 ConA 与 WGA 结合 FASP 技术，从 11 种乳腺癌细胞系中鉴定出 701 种蛋白、1398 个 N-糖基化位点。
Li 等人（2013）[10.1371/journal.pone.0081921] 发展了 LecSPEG 方法，使糖基位点识别数量和特异性显著提升。
5. 亲水相互作用色谱（HILIC）
HILIC 通过保留亲水肽段（包括糖肽）实现分离。ZIC-HILIC 进一步增强分辨率，但非糖肽保留仍影响特异性。
6. 硼酸富集（Boronic Acid-based Enrichment）
硼酸结合可识别更广谱糖链，鉴定出的糖蛋白数量优于凝集素方法[10.1021/acs.jproteome.6b00953]。
7. 肼化学富集（Hydrazide Chemistry-based Enrichment）
Li 等人（2013）[10.1371/journal.pone.0081921] 结合 MS、肼化学与 ZIC-HILIC，从细胞系中鉴定出 611 种糖蛋白、1213 个 N-糖位点。
8. 代谢标记富集（Metabolic Labeling-based Enrichment）
使用糖类似物（如 ManNAz）进行代谢标记，可实现分泌糖蛋白的选择性富集和动态追踪[10.1126/science.276.5315.1125]。
hiSPECS 技术进一步降低样本量需求，并应用于多种细胞类型。
9. 信号增强策略（Signal Boosting Approach）
利用 TMT 同位素标签的多重定量策略可提高重现性并缩短分析时间，同时增强低丰度肽段信号[10.1186/s13059-018-1547-5]。
Russell 等人[10.1002/rcm.7777]和 Suttapitugsakul 等人[10.1021/acs.analchem.9b01447]结合该方法研究临床样本和带有 GalNAz 标记的分泌糖蛋白。
细胞外囊泡糖蛋白研究方法
外泌体富含糖蛋白。常用的外泌体分离方法包括超速离心、密度梯度分离、SEC 层析等，不同方法会影响糖蛋白谱。
凝集素亲和色谱常用于富集外泌体糖蛋白。Saraswat 等人（2015）[10.1074/mcp.A114.040345] 在尿液外泌体中鉴定出 126 个 N-糖肽、37 个糖蛋白。
此外，基于 HILIC、纳米复合材料（如 MoS₂/Au-NP）及代谢标记的技术也被开发以增强糖蛋白检测。
如何鉴定含血清培养基中的分泌蛋白？ #284
