蛋白质交联剂 (Protein crosslinker) #294
光敏交联剂（Photoreactive crosslinker，光反应性交联剂）使用光反应性功能团（如双吖丙啶、苯基叠氮、二苯甲酮），通过暴露于紫外光下与目标分子发生反应。
理想的光敏反应试剂应具有高反应性，同时在黑暗中保持稳定，在不会对生物样本造成任何光解损伤的波长下非常易受光照的影响。大多数光敏交联剂是异双官能试剂，其中包含双吖丙啶或benzophenone基团，以及胺基或巯基反应性基团。
(a) 叠氮化合物可以异构化为线性重氮化合物，主要与蛋白质中的羧酸（谷氨酸和天冬氨酸）反应，而卡宾主要与亲核试剂反应（另见图 1D）。
(b) 两种著名的叠氮交联剂的结构：异双功能试剂 Sulfo-SDA（磺基琥珀酰亚胺 4,4′-偶氮戊酸酯）（上图）和非天然氨基酸光敏甲硫氨酸（Photo-Methionine），后者可以在翻译过程中掺入蛋白质中（下图）。
双吖丙啶（Diazirine）
双吖丙啶（diazirine） 是一种在多种化学条件下均具有高稳定性的光敏基团。
在约 365 nm 紫外光照射 下，它能高效光解生成高反应性的碳烯（carbene），该碳烯可插入 C–H 或 N–H 键，从而与所有 20 种氨基酸发生反应，且反应速率极快（通常在毫秒级内完成）。
含有双吖丙啶的 氨基酸类似物 [10.1038/nmeth752] 可用于非特异性交联邻近残基。
光敏交联剂尤其适合用于研究疏水区域的相互作用，因为这些区域往往缺乏可反应的赖氨酸残基（例如膜蛋白的跨膜区），传统的残基特异性交联剂难以作用于此类位点。
然而，越来越多的研究表明，双吖丙啶对 酸性氨基酸残基（如天冬氨酸和谷氨酸）具有较高反应性 [10.1007/s13361-017-1730-z][10.1021/jacs.1c02509]。
双吖丙啶与羧酸反应的主要途径是经由线性 二氮化合物（diazo compound） 中间体形成酯键 [10.1021/acs.analchem.7b04915]。
系统的标记偏好性研究表明，烷基双吖丙啶 以 pH 依赖性 方式更倾向于标记酸性氨基酸，这与其反应性烷基二氮中间体的特征一致。
此外，由此产生的 酯型交联产物 可在质谱分析中被裂解，便于通过专用软件进行自动识别与分析。
因此，双吖丙啶为光交联酸性羧酸残基提供了一种新的化学途径，并可用于在蛋白质中对多种氨基酸进行广泛标记 [10.1146/annurev.bi.62.070193.002411][10.1021/acs.analchem.6b02082]。
示例化合物包括：
- SDAD（succinimidyl 2-(p-azidophenyl)acetate diazirine） [10.1002/jms.1776]
二苯甲酮（Benzophenone）
与双吖丙啶相比，二苯甲酮（benzophenone） 具有不同的光化学特性。
在光照条件下，它生成一个 双自由基（biradical） [10.1021/bi00185a001]，该自由基能从附近反应伙伴中抽取一个氢自由基，随后形成 烷基自由基，并通过光引发物（photophor）与氨基酸残基之间生成新的 C–C 键。
不同于双吖丙啶，二苯甲酮的激活并非通过光解离机制进行，因此该过程是可逆的。
这使其在特定条件下具有更好的反应控制性，但也可能降低交联效率。
局限性（Limitations）
非特异性交联常导致复杂的产物混合物，使数据库搜索和结果解析更加困难。
此外，同一分子间相互作用可能对应多种交联肽段，从而稀释单一交联事件的信号丰度。
这些因素共同增加了质谱数据解析的复杂度，限制了光交联技术在单蛋白研究中的应用范围。
