蛋白质交联剂 (Protein crosslinker) #294
天冬氨酸（Asp）与谷氨酸（Glu）残基约占所有氨基酸的 12%，通常暴露于蛋白质表面，并在蛋白质–蛋白质相互作用中发挥重要作用。因此，Asp/Glu 是绘制相互作用接触点的高潜力交联靶标。
然而，Asp/Glu 的 羧基（carboxyl） 仍然相对难以直接标记。若能开发出高效、选择性并兼容温和温度与 pH 条件的羧基交联策略，将对结构生物学研究产生重要推动。目前多种新型与羧基反应的交联原理仍在探索中，目标是实现高产率、低副产物并在多数蛋白可耐受的条件下运行。
碳二亚胺（Carbodiimide）
碳二亚胺（carbodiimide） 是一类常用的偶联试剂，可激活羧酸并将其直接与蛋白质中的氨基基团连接，且不引入额外间隔链，因此被称为“零长度（zero-length）”交联试剂。代表性试剂为 EDC。碳二亚胺通常用于在空间上非常接近（< 3 Å）的基团之间形成酰胺键，且在 pH 4.5–7.5 条件下反应较佳 [10.1021/ja00961a045]。为提高产率，常与第二试剂（例如 sulfo-NHS）联用以稳定中间体。
早期工作表明，在约 pH 5.5 的条件下，用 EDC 激活的 Asp/Glu 可与二水合腙类交联试剂进行酸性残基靶向交联（Novak & Kruppa）[10.1255/ejms.963]。在高密度交联策略中，EDC/sulfo-NHS 由于能产生大量交联产物，常被用于后续的计算建模 [10.1073/pnas.1902931116]。
但需要指出的是，EDC 介导生成的交联产物与原始肽段的质量仅相差一个水分子（loss of H₂O），而肽段质谱中经常出现脱水峰，这增加了交联分配的不确定性。因此，需要在 MS/MS 实验中对交联肽段进行接近完全的解离，以验证序列并定位精确交联位点。
DMTMM 与肼基介导的羧基交联
2014 年引入的一种方法使用偶联试剂 DMTMM（4-(4,6-二甲基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉）与 肼基交联剂 将蛋白质中的羧基连接起来 [10.1073/pnas.1320298111]。DMTMM 首先激活 Asp/Glu 的羧基，随后这些活化的羧基与肼类交联剂（例如己二肼酸 PDH）反应形成交联。该反应可在中性 pH（7.0–7.5）下进行，更接近日常生理条件，但为了获得高效交联通常需要较长时间和 37°C 的孵育，具体条件依目标蛋白而定。值得注意的是，在 DMTMM 存在下常观察到零长度（羧基–氨基）交联，这是由于 DMTMM 直接将羧基与氨基连接所致。
为简化酸性残基交联肽段的鉴定，Lan Huang 等开发了含亚砜的 MS 可裂解酸性残基特异性二水合腙（DHSO），其利用了与识别赖氨酸靶向 DSSO 相同的 MSⁿ 工作流程 [10.1021/acs.analchem.6b02240]。由于 Asp/Glu 靶向交联在多样性与复杂性上高于赖氨酸交联，DHSO 的可裂解特性大大简化了 Asp/Glu 交联肽段的识别，从而为互补的相互作用接触点提供了有力证据，利于解析蛋白复合物结构。
另一类替代策略依赖于基于重氮化学的 Diazoker 试剂 [10.1021/acs.analchem.7b03789]。也有研究将 ECD（电子俘获解离）或 1-羟基苯并三唑的化学策略与二胺联用，在活化后实现羧基交联 [10.1021/acs.analchem.7b05135]。这些方法虽然各有优势，但均需对反应条件进行精细控制，以避免引入人为伪迹。
最近的一项系统性研究优化了 DMTMM 与 PDH 的反应条件，以在蛋白质中实现零长度（羧基–氨基）交联与肼基（羧基–羧基）交联的平衡与形成 [10.1021/acs.analchem.0c03926]。该类研究为在温和、可控条件下靶向酸性残基提供了有价值的参考。
