甲醛交联 (Formaldehyde crosslinking)

一号

甲醛（Formaldehyde, FA） 是最早被用于生物体系中的交联剂之一，几十年来一直作为组织固定剂与防腐剂使用。近年来，它再次引起关注，被用于 体内蛋白质–蛋白质相互作用（PPI） 的交联研究 [10.1002/jms.1415]。

化学特性与交联机理

由于分子尺寸极小，甲醛能够高效穿透细胞壁与膜，对细胞和组织具有优异的渗透性，从而可实现 蛋白质–蛋白质 [10.1073/pnas.82.19.6470]、蛋白质–核酸、甚至 核酸–核酸 [10.1021/bi00677a030] 之间的交联。
然而，甲醛的化学反应途径复杂，产物混合物异质性高，导致其质谱解析较为困难。
甲醛为最简单的双功能交联剂，其两个反应位点可在极短距离（2.3–2.7 Å）内连接功能基团。

早期研究假设 FA 通过在相邻氨基酸间形成 甲基桥（R¹–CH₂–R²） 完成交联 [10.1021/ja01188a018][10.1016/s0079-6603(08)60099-9]。理论上该交联使总质量增加 12 Da，对应一个碳原子。的确，在 FA 处理后观察到肽段质量增加 12 Da 的现象 [10.1074/jbc.M310752200][10.1021/bc050340f][10.1016/j.aca.2008.04.049]，但尚无直接证据表明这些变化源于真正的交联而非局部修饰。

FA 交联产物可通过加热（如煮沸）逆转 [10.1002/jms.1415]，因此在样品分析前具有一定的可控性。
然而，与 NHS 酯类等可控化学试剂相比，FA 的 非特异性反应性高、交联臂极短，使得交联肽段的质谱鉴定极具挑战性。

蛋白质交联反应途径

甲醛交联的第一步涉及 赖氨酸（Lys）侧链 ε-氨基、N 端胺基、脯氨酸（Pro）次胺 及 色氨酸（Trp）环氮 等可供反应的位点。
第一步生成 亚胺（methanol imine），其主要形成于赖氨酸的胺基上。随后，这些修饰可与其他氨基酸反应，包括组氨酸（His）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）、酪氨酸（Tyr）酚环邻位、色氨酸侧链氮或精氨酸（Arg）胍基团 [10.1002/jms.1415]。

这种多反应位点的特性使得 FA 交联的产物复杂且异质。

应用与方法学发展

在 PPI 研究中，FA 交联可在低浓度（< 1%）和短时间（几分钟）条件下进行，以限制交联多样性并保持蛋白复合物的原生状态。
质谱研究表明，10 分钟内 FA 即可引起显著修饰 [10.1002/jms.1415]，且肽段中氨基酸的空间邻近性与局部环境均影响反应性。

Guerrero 等（2006） 将 FA 交联与 SILAC 定量策略 结合，用于鉴定酵母 26S 蛋白酶复合物的相互作用蛋白 [10.1074/mcp.M500303-MCP200]。FA 的一个优势是交联可热解，使其与质谱分析高度兼容，并可配合 共免疫沉淀（co-IP） 进行特异性复合物富集。

随后发展的 SPINE（Strep–protein interaction experiment） 方法 [10.1002/pmic.200700491] 展示了 FA 交联在 PPI 研究中的实用性：诱饵蛋白带有 Strep 标签，经 FA 交联后与链霉亲和素或 Strep–亲和素基质结合，强洗涤后用生物素或去硫生物素洗脱。FA 交联的可逆性保证了复合物的温和解析。其改进版 Membrane–SPINE 进一步扩展至膜蛋白互作体系 [10.1002pmic.201000558]。

机制再评估与最新进展

Kalisman 课题组（2020） 对 FA 交联进行了系统分析 [10.1038/s41467-020-16935-w]，发现交联产物并非传统认为的 12 Da 甲基桥，而是两个亚胺修饰赖氨酸侧链形成的二聚体（质量增加 24 Da）。该反应仅在结构化蛋白中（而非肽段中）发生，说明其依赖于赖氨酸侧链的空间接近性。虽然研究未明确提出产物结构，但该发现重新定义了 FA 交联的化学基础，也解释了为何早期研究难以检测到稳定的交联肽段。

然而，Kalisman 的研究中仍仅鉴定到有限数量的 PPI，提示 FA 交联肽段的有效鉴定方法 仍有待进一步开发。如何将 FA 交联与高分辨率 MS/MS 技术结合，实现 体内全局蛋白质互作图谱（in vivo XL-MS mapping），是未来的重要方向。

甲醛交联除研究蛋白质–蛋白质相互作用外，还广泛用于 蛋白质–DNA/RNA 互作研究，如 染色质免疫沉淀（ChIP） 等技术。