蛋白质交联剂 (Protein crosslinker) #294
可断裂交联剂（Cleavable Crosslinkers，可切割交联剂） 是一类在特定化学或物理条件下能够发生 可控裂解（cleavage） 的交联试剂。与传统的非可切割交联剂（Non-cleavable crosslinkers）相比，这类试剂在 样品复杂度降低、交联肽鉴定简化、定量分析以及多层级结构解析 等方面展现出显著优势。
它们在交联质谱（XL-MS）中已成为连接 蛋白质组学分析 与 结构生物学研究 的重要化学工具。
目前大多数研究仍然依赖传统的、不可切割的胺反应性NHS酯交联剂。例如 BS³ 和 DSS依然是结构生物学实验室中用于单蛋白和小型蛋白复合物研究的标准工具。
结构
可断裂交联剂通常由三部分组成：
反应性官能团（Reactive groups）
通常位于交联剂两端，用于与蛋白质中的特定官能团（如赖氨酸的氨基、半胱氨酸的巯基或羧酸）形成共价键。
间隔臂（Spacer arm）
连接两端的化学桥梁，其长度决定了所施加的结构距离约束（通常为 5–30 Å）。
可切割位点（Cleavable site）
位于分子中部或反应性基团附近，在特定条件（如光照、还原、电荷碰撞或酸性条件）下断裂，从而释放交联的肽段。
这种设计允许研究者在交联、酶解及质谱分析的不同阶段，通过控制断裂条件选择性地“解离”交联臂，实现结构信息的层级提取。
分类
根据其 断裂机制（cleavage mechanism），可断裂交联剂主要分为以下几类：
化学可切割型（Chemically cleavable）
在酸性、还原性或氧化性条件下断裂。
- 代表：DTSSP（含二硫键，可被DTT还原断裂）
- 优点：操作简单，可在蛋白质水平控制断裂；
- 局限：断裂条件可能影响样品稳定性。
光可切割型（Photocleavable）
含有光敏基团（如二苯甲酮、双吖丙啶、芳香酮等），在紫外或近紫外光照下裂解。
质谱可切割型（MS-cleavable）
在质谱的 CID、HCD 或 ETD 实验中于特定位点断裂，生成特征性离子。
酶可切割型（Enzymatically cleavable）
含有特定酶识别序列（如Trypsin、TEV protease等），通过酶切选择性断裂。
优点：高度特异，兼容生物样品；
局限：设计复杂，适用体系有限。
质谱可切割交联剂（MS-Cleavable Cross-Linkers）
在 全蛋白组学规模的XL-MS分析 中，不可切割的交联剂的使用面临显著挑战：复杂混合物中交联肽段的搜索空间巨大（理论上为 n² 级），而且交联肽的碎片谱复杂、可识别性差。
质谱可切割交联剂 的核心优势在于，它们在 MS/MS（尤其是 CID）实验中能够在预设的化学键处发生断裂，释放出 特征性碎片离子（signature ions）。
这些特征离子可直接揭示连接的两个肽段的单独质量，从而显著简化数据分析过程：
交联肽的搜索空间从传统的二次组合（n²）降低为线性组合（2n）[10.1007/s13361-014-1001-1]。
这使得在复杂体系中——如细胞、组织或原位生物样品中——也能快速、准确地定位交联位点。
图 6. 质谱可切割交联剂通过在MS/MS阶段断裂交联臂来减少搜索空间（ACS Chem Rev. 2021, 121, 11360–11405）。
类型与切割化学
目前已开发出多种在 CID、HCD 或 ETD 条件下可裂解的交联剂，其 spacer arm 中含有能量较低的化学键，如 C–S、N–O 或尿素键 等（表1）。
一些交联剂具有 双重切割能力，可在 CID 与 ETD 模式下均被断裂，从而适用于不同类型的质谱仪和碎裂机制 [10.1021/acs.analchem.6b02886]。
此外，部分基于自由基的可切割交联剂（FRIPS）在诱导肽段的 ETD-like 碎裂 方面表现出潜力 [10.1002/mas.21568]，但目前仍主要用于较简单的体系。
工作流程与代表性试剂
在可切割交联剂的基础上，已经建立了多种自动化的分析工作流程，例如 Protein Interaction Reporter (PIR) 与 SuDP 策略 [10.1021/ac0613840][10.1021/ac101030w]，通过 MS² 或 MS³ 实验即可实现交联肽的高置信度识别。
其中两种具有代表性的试剂是：
1. DSBU（Disuccinimidyl Dibutyric Urea）
[[DSBU]]（又称 BuUrBU）是一种 对称的同二官能交联剂 [10.1021/ac101241t][10.1038/s41596-018-0068-8]。
其中央 尿素键 的断裂能与肽键相似，因此在常规 MS/MS 实验中即可同时检测到：
交联剂裂解形成的 特征性碎片离子，以及
源自肽骨架的 b- 和 y-型离子。
这意味着无需进行 MS³ 实验，所有具备串联质谱（MS/MS）功能的仪器均可用于 DSBU 交联肽的直接分析。
这种兼容性大幅降低了实验门槛，使 DSBU 成为高通量结构蛋白组学研究的常用可切割交联剂之一。
2. DSSO（Disuccinimidyl Sulfoxide）
[[DSSO]]（二琥珀酰亚胺亚砜）是另一种广泛应用的 MS可切割交联剂 [10.1074/mcp.M110.002212]。
其中心 C–S 键 的键能低于肽骨架酰胺键，使得 DSSO 在 CID 或 HCD 实验中优先断裂，生成一组特征性的诊断离子。
随后通过 MS³、ETciD 或 EThcD 实验可对连接的肽段进一步测序，从而获得完整的交联信息 [10.1038/ncomms15473]。
这种逐级碎裂的工作流程已被多个实验室标准化，实现了从交联样品到结构模型的高效自动化分析。
